拟研究的问题:
将已制备好的HSV2 gC 蛋白作为抗原免疫小鼠,获得含HSV2 gC 蛋白抗体的血清,然后取出能产生相应抗体小鼠的脾B淋巴细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤细胞,获得能产生抗HSV2 gC 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。
采用的研究手段:
动物实验阶段,使用BALB/c小鼠,通过设计合理的免疫周期、免疫剂量、免疫方法及免疫佐剂的使用,尽可能提高小鼠免疫反应的强度,从而得到更高效价的免疫血清。免疫周期结束后取出小鼠脾B淋巴细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG诱导下融合。使用HAT培养基筛选成功融合的杂交瘤细胞,再通过有限稀释法、酶联免疫吸附试验进一步得到产生单一抗体的杂交瘤细胞。
其中涉及的技术手段如下:动物实验技术、血清分离技术、等密度区带离心法、动物细胞体外培养技术、PEG诱导动物细胞融合技术、HAT培养基筛选法、有限稀释法、酶联免疫吸附试验、动物细胞冻存技术。
文献综述:
疱疹病毒科(Herpesviridae)是属于有包膜的线状双链DNA病毒, 它广泛存在于自然界中, 目前已鉴定或部分鉴定的约有100种。根据病毒的理化性质、生物学特性将疱疹病毒分成a、szlig;、gamma;三个亚科。单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus HSV)属于疱疹病毒科a病毒亚科,病毒质粒大小约180纳米。具有典型疱疹病毒形态特征。根据生物化学、生物学、流行病学等分为两个血清型,即HSV-1和HSV-2。HSV-1主要感染口、眼、唇的皮肤和粘膜、以及中枢神经系统,偶见于外生殖器;HSV-2一般与外生殖器感染和新生儿感染有关,偶见于口腔病变。二者基因组相似,序列有50%的同源性,通过DNA限制性内切酶分析来区分。HSV基因组大约152kb,34个基因,编码70多个多肽。特别是基因编码的晚期蛋白中有12种包膜糖蛋白(gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gJ、gK、gL、gM、gN),有些功能较清楚。其中gB和gD与病毒吸附和穿入有关,是与细胞特异性受体相互作用的病毒配体分子。gD诱导产生中和抗体的能力最强,可用于研制疫苗。gC是补体C3b―结合蛋白。gE是Fc受体,可与IgG的Fc端结合。gG为型特异性抗原,以此抗原能区别HSV-1(gG-1)和HSV-2(gG-2)。gH与病毒的释放有关。
HSV感染现已成为世界上第四大传染病,经呼吸道(主要鼻咽部)、口腔、眼、生殖器粘膜以及破损皮肤进入体内, 造成龈口炎、脑炎、角膜结膜炎、生殖器疱疹等疾病。尤其孕妇感染 HSV后, 易发生流产, 造成胎儿先天畸形和智力低下, 约40 %~60%的新生儿在通过产道被HSV-2感染后, 出现高热、呼吸困难和中枢神经系统病变, 其中60%~70 %受染新生儿可因此而死亡,幸存者中后遗症可达95%。在人群中约90%以上的人曾感染过HSV , 其中很大一部分导致潜伏感染, 病毒在体内可维持数年以致终生。临床上使用疱疹净、阿糖腺苷、无环鸟苷等抗毒药物治疗HSV感染时, 常出现耐药现象, 均难以清除病毒潜伏, 因此HSV潜伏感染的机制已成为目前这方面的研究热点。
接种疫苗仍是预防病毒感染的理想方法。作为一种理想的 HSV疫苗, 应该可以诱发消除性免疫 ,亦即在 HSV侵入人类机体的各种途径如生殖道、口鼻粘膜等时都能够诱发有效的免疫应答,并且对病毒的再感染具有抵抗力 。为了研制出一种有效的疫苗,人们曾进行过很多尝试,其中一些疫苗已经进入到临床评价阶段, 例如亚单位疫苗、减毒活疫苗、核酸疫苗等。尽管这些疫苗在针对不同动物的试验中取得了一系列令人鼓舞的结果 , 如能够诱发高滴度的特异性中和抗体 、有效地保护动物免于急性病毒攻击等, 但却无法有效阻止病毒在人体内的再复发或者仅在 HSV-1、HSV-2血清学反应均为阴性的女性中起到一定的作用。
抗HSV单克隆抗体的制备,对于研究HSV的抗原结构、毒株变异、流行病学特征、预防性亚单位疫苗、与某些肿瘤的相关性以及临床上对疱疹性疾病的准确、快速诊断都具有较大的实用价值及应用前景。早期的HSV单抗制备主要是使用完整的HSV病毒免疫小鼠,常规免疫产生的抗体多针对gD、gB、gC、gE等包膜蛋白。使用病毒表面的一种糖蛋白免疫小鼠,可以针对性的制备该糖蛋白的单克隆抗体,从而开发、制备全套的HSV抗原检测及分型试剂盒。为HSV的预防性亚单位疫苗的研制奠定基础。
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