利用crispr-cas9技术构建食蟹猴多能干细胞报道细胞系文献综述

一、研究内容及目的

肝脏作为人体最大的内器官，承担了胆汁合成，食物成分代谢，解毒，通过糖原贮存调控血糖水平以及控制血环境稳态等重要功能。对于肝脏出现严重异常的患者，肝移植是目前能实现的最好的救治手段。然而肝移植普遍面临着供体不足，免疫排斥等问题。近几年兴起的iPS技术可以很好地解决上述问题。然而在iPS技术应用于临床救治前，还有大量临床前研究需要进行以确认该技术的有效性及安全性。

Albumin作为肝细胞从分化起始便一直表达的蛋白，可以用来很好地监控体内肝细胞功能及生长状况。本课题通过CRISPR/CAS9技术构建了食蟹猴iPS的Albumin报道细胞系，为之后体内监测iPS分化的肝细胞在肝受损食蟹猴肝内的生长状况打下了基础。通过确认其在肝内的生长状况，我们可以部分判断该技术在同种iPS移植方面的有效性，进一步推动其临床应用。

二、研究手段及主要成果形式

通过CRISPR/CAS9技术在猴Albumin第三个外显子和终止密码子间插入luciferase-T2A-mCherry序列，构建猴iPS的Albumin报道细胞系。体外诱导该iPS细胞系分化为成熟肝细胞并移植入受损猴肝脏，观察其在猴肝脏内的生长状况及对猴的救治作用。

由于暂时缺乏猴iPS细胞，本人只需完成CRISPR质粒及donor质粒的构建即可。

三、论文课题研究进度安排

3月14日前确定选题，查阅文献。

3月14日----3月20日 撰写开题报告。

4月中上旬中期检查

5月27日前 完成毕业论文初稿

6月8日前 上传毕业论文终稿

四、文献综述

1.食蟹猴

非人灵长类动物在形态结构，遗传，生殖生理和代谢功能等方面与人类相似。与其他动物相比较，有关非人灵长类动物生理、病理的研究结果对认识人类疾病的发生机理等医学研究有更为重要的参考意义。灵长类有数十种，过去较为常用的是恒河猴，但由于1978年印度禁止了非人灵长类的出口，恒河猴数量便不能满足研究的需要。猕猴属在遗传物质上与人有 75%-98.5%的同源性，作为另一与人类相近的属，近年来逐渐取代恒河猴成为新的生物研究用的理想实验动物。猕猴属的食蟹猴来源容易，价格低廉，是近年来常用的实验猴之一。

食蟹猴属灵长目，类人猿亚目，狭鼻猴附目，猕猴亚科，猕猴属。体形比恒河猴小，身长不超过50公分，尾长为头和体长的1-1.5倍，头上有小尖头毛或灰色腮须；眼围皮裸，眼睑上侧有白色三角区；耳直立目色黑；鼻子平坦，鼻孔很窄；腹毛及四肢内侧毛色浅白。多分布于泰国与越南，马来西亚，苏门答腊，爪哇，帝汉及临近小岛，婆罗洲，菲律宾，缅甸等地。因为喜欢在退潮后到海边觅食螃蟹及贝类，故名食蟹猴。

食蟹猴作为实验动物具有以下优点：1)资源丰富，实验成本低；2)体型小，长尾，性格温顺，易于抓捕及实验操作；3)繁殖周期短，且无季节性；4)因体型偏小，用药量少；5）近几年来研究越来越多，在NCBI，EBI等数据库中，可获取大量的该物种的基因组信息。综上，本研究选择食蟹猴作为研究对象。

2.CRISPR/CAS9技术

CRISPR/CAS9技术作为继ZFN，TALEN之后的第三代基因编辑技术，凭借其简便廉价等优势正得到越来越广泛的应用。

CRISPR技术在应用前经历了漫长的研究，其研究历史如下：1987年，ishino等人在k12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列；2000年Mjica等发现这种间隔重复序列广泛存在于各种原核生物的基因组中；2002年，Jansen等提议将将其正式命名为clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)。2005年，三个研究小组均发现CRISPR的间隔序列与宿主菌的染色体外的遗传物质高度同源，推测其功能可能与细菌抵抗外源遗传物质入侵的免疫系统有关；2006年，美国研究小组通过生物信息分析预测，CRISPR系统可能以类似于真核生物的RNAi的方式行使其免疫功能；2007年，Barrangou等首次发现并证明细菌可能利用CRISPR系统抵抗噬菌体入侵；2008年，Marraffini等又发现细菌CRISPR系统能阻止外源质粒的转移，首次利用实验验证了CRISPR系统的功能。之后经历了几年对CRISPR系统组成及机制的研究，终于于2013年Cong等在真核细胞中利用CAS9进行了基因编辑，2014年Jinek等测出了CAS9蛋白的晶体结构，正式揭开了CRISPR应用的序幕。

CRISPR系统根据切割外源DNA这一过程中参加成分的不同可分为三种类型，现广泛应用于基因编辑的CRISPR系统属于第二型。第二型切割外源DNA需要的蛋白只有CAS9，相对一三两种类型更为简单，因此得到了广泛的应用。

二型CRISPR在菌体内的作用过程大体可分三个阶段，即Spacer的获得，crRNA的转录与成熟以及对外源DNA的定点切割：1）cas1，cas2，csn2在Spacer的获得中发挥重要作用。首先，功能蛋白扫描入侵的外源DNA，寻找其中的PAM位点，即一段特定的序列（如对生脓链球菌就是NGG，N代表任一碱基。）。然后在其上游邻近位置（相差1-4个bp）选取一段20-30bp的序列作为protospacer。再之后，细菌通过未知机制在CRISPR 5端合成新的正向重复序列并将protospacer的序列插入其中，完成Spacer的获得；2）在RNA聚合酶的作用下CRISPR序列被转录出来，称为pre-crRNA。pre-crRNA在CAS9蛋白，tracaRNA以及RNase III的作用下被切割成包含spacer及部分重复序列的一个个小段，称为crRNA（重复序列对于crRNA的稳定，crRNA与tracaRNA的结合以及细菌避免自身免疫的发生都具有重要作用。）。至此完成crRNA的成熟。3）CAS9蛋白，crRNA以及tracrRNA三者形成复合物，识别外源DNA的PAM序列，并通过crRNA与protospacer互补配对。之后CAS9蛋白通过其HNH核酸酶结构域在互补链PAM 5端第三个碱基外侧产生一切口；通过其RuvC核酸酶结构域在非互补链PAM上游3-8个碱基之间进行切割。由此完成对外源DNA的切割破坏，保护自身。

利用CRISPR进行基因的突变，插入或敲除则是通过DNA产生切口后细胞自身的修复完成。修复机制主要包括非同源末端链接以及同源重组（需要提前合成期望的模板与CRISPR质粒共转染）两种。然而非同源末端链接易出错，风险大，尤其在脱靶时常常造成严重后果，因此有必要降低其使用而增加同源重组的使用。为此，Martin等突变了CAS9蛋白两个核酸酶结构域中的一个，使之只能切开单链，即成为切口酶。据研究，单链断裂仍能引起同源重组，但没有引发非同源末端链接的能力，成功减少了CRISPR基因编辑中的错误，降低了其风险。

另外，Martin等人还尝试将crRNA与tracrRNA表达为一条嵌合RNA，称sgRNA，并在体外证明sgRNA可以正常发挥功能。由此大大简化了CRISPR基因编辑的应用过程，推动了其广泛应用。

现在，利用CRISPR系统进行基因编辑已经有了商业化的质粒（共表达sgRNA与CAS9蛋白）和成熟的protocol。用户仅需合成20bp的gRNA（从靶标序列中PAM 5端选取）与期望的模板，并将其分别连入商品化的CRISPR质粒与适合转染的质粒载体，再将其转染入目的细胞即可实现基因编辑，简单快捷，任何实验室都可以轻松使用。

然而CRISPR技术依旧有进步的空间。脱靶效应是现在CRISPR基因编辑技术亟待解决的问题。有报道称缩短gRNA到17bp可以有效减少脱靶现象；另外利用CAS9-FOK I融合蛋白也可以在一定程度上减少脱靶。不论如何，怎样更好地解决脱靶问题必然是现在有关这一新兴基因编辑技术研究的重点与热点。

3.iPS技术以及谱系重编程治疗肝病的研究现状

肝脏起源于靠近心脏中胚层的内胚层前肠部分。肝脏发育历经了liver diverticulum的产生，liver bud的产生，肝母细胞向胆管细胞或肝实质细胞分化以及出生前后进一步成熟等过程。在胚胎干细胞向肝脏发育的过程中，Nodal，FGF，BMP，hHEX，GATA，WNT等信号在不同阶段发挥着重要作用。

肝脏作为人体最大的内器官，承担了胆汁合成，食物成分代谢，解毒，通过糖原贮存调控血糖水平以及控制血环境稳态等重要功能。对于肝脏出现严重异常的患者，肝移植是目前能实现的最好的救治手段。然而肝移植普遍面临着供体不足，免疫排斥等问题。近几年兴起的iPS技术和谱系重编程技术可以很好地解决上述问题。

日本科学家山中伸弥于2006，2007年通过病毒转导oct4，sox2，c-myc，klf4四因子分别实现了小鼠和人成纤维细胞的去分化，冲击了过去细胞分化无法逆转的观点，揭开了iPS技术应用的序幕。

利用iPS和谱系重编程获得功能肝细胞已经有了一些研究。Espejel等人曾报道利用野生型ips细胞分化肝细胞成功救治Fah缺陷小鼠；邓宏魁等人则利用肝脏特异表达的一些因子将成纤维细胞转分化为功能肝细胞，成功救治Fah缺陷小鼠；惠利健等人亦利用几种转录因子将成纤维细胞转分化为功能肝细胞并成功救治Fah缺陷小鼠及药物诱导的急性肝衰小鼠，之后他们还利用转分化出的肝细胞制造人工肝装置成功修复了急性肝衰猪的肝脏功能并促进了其肝的再生。

尽管如此，利用iPS分化肝细胞救治灵长类的研究还鲜有报道。本研究探究了食蟹猴自体iPS细胞分化肝细胞对于肝受损食蟹猴的救治作用及潜在的不良反应，进一步推进了iPS细胞在肝病方面的临床应用。

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