无缝克隆方法研究
摘要：分子克隆是一种利用体外重组技术实现在分子水平上扩增特定DNA片段的方法。最常用的基因克隆方法是双酶切构建载体方法，但该方法耗时耗力。无缝克隆技术是近年来发展的一种快速、简单且高效的DNA定向克隆方法，并经过不断的技术改进，实现了大分子DNA片段的克隆和多片段DNA无缝连接。但是对于单引物克隆以及不经PCR扩增的外源基因克隆却少有研究。为实现把不需经过PCR扩增的外源基因片段克隆到目的载体中，并实现多片段单链寡核苷酸无缝克隆，仍需不断的实验探究。
关键词：双酶切技术 无缝克隆 PCR 单链寡核苷酸
分子克隆是一种利用体外重组技术将特定基因插入载体分子中，从而实现在分子水平上扩增特定DNA片段的方法，是基因工程的一种重要技术手段。最常用的基因克隆方法是在PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，利用限制性内切酶酶切构建载体，再在连接酶的作用下将同样经限制性内切酶切割得到的带有相同黏性末端的目的基因片段与载体连接。但是这种方法操作复杂，酶切效率和连接效率不高，难以满足高通量需求。[1,2] 无缝克隆技术一次性允许两个或更多DNA片段精确连接，不受酶切位点的限制，是近年来发展的一种快速、简单且高效的DNA定向克隆方法。[2] 基因融合技术在基因功能研究的许多方面具有重要作用，包括基因和蛋白质标记，报告基因研究，结构域交换研究，诱变研究和基因插入或敲除实验[3]。
1. 无缝克隆应用
1.1 启动子和外显子研究
分子进化方法，如外显子和DNA改组，用于生产具有所需生物化学或生物物理特性的蛋白质，也需要无缝拼接各种功能元件，以加快基因进化速度[4]。在真核细胞中，可以通过内含子介导的RNA剪接产生嵌合基因或蛋白质[5,6]。在这些实验中，合成RNA底物和外显子标记的核酶通常需要仔细设计和产生嵌合前体基因。只要嵌合基因正确生成，就可以在拼接时实现无缝融合。
1.2蛋白质功能研究和蛋白质工程
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