一、实验背景
近十几年来血栓性疾病发病率上升，严重危害人类的健康。目前临床使用的抗血栓药物存在易出血等不良反应[1]。大量临床资料表明，先天缺乏凝血因子XI(Factor XI, FXI)的患者患缺血性脑卒中及深静脉血栓的比率明显降低，且一般无自发性出血。由于FXI的这一特点，对新抗凝方案探索的目光聚焦到了FXI抑制剂的开发上。而在此过程中，势必会需要大量的科研试剂FXI，以作为靶标去筛选高亲和力的抑制剂，然而目前实验室使用的科研试剂FXI主要由国外各大试剂公司生产，我国主要依赖进口，可及性较差，是目前新型抗血栓药物研发中的一道技术壁垒。本课题拟采用毕赤酵母X33表达凝血因子FXI催化结构域，并对其进行理化表征。
凝血因子XI（coagulation factor XI，FXI）是一种丝氨酸蛋白酶原[1]，在内源性凝血过程中发挥作用。活化因子XI (Activated Factor XI, FXIa)是凝血级联扩增阶段的关键酶。FXⅠ由二硫键连接的 2 个完全相同亚基构成,其中每条多肽链上含607个氨基酸，单体分子质量在80 kD左右, 同源二聚体分子质量为160 kD。每个亚基分为重链 (N 端催化区域，为 4 个 AP 结构域 (apple domain, A1～A4)和轻链 (C 端催化区域)[2]。F X I在凝血蛋白酶中是独特的，FXI可以裂解内在凝血通路中的IX因子。它作为一个二硫键连接的同源二聚体循环，每个多肽在N端有4个同源的苹果结构域(指定为A1、A2、A3和A4)。FXI酶原的全长晶体结构，揭示了蛋白酶和四个苹果结构域组装成一个独特的“杯碟”结构。
FXI CD域是完整FXI分子的轻链，包含其第370~607个氨基酸[3]。在我们前期预实验中，利用生色底物法在体外测定FXI CD域与特异性底物以及在抑制剂存在下的酶动力学发现其与完整FXI具有相当的功能活性[8]，它可以替代完整的FXI。同时由于许多FXI抑制剂的靶点都位于FXI CD域[3-7]，因此FXI CD域是用于在体外筛选以FXI CD域为靶点开发新型抗凝抑制剂的重要科研试剂，[1-2]X-33毕赤酵母被用来表达含有Zeocin（博来霉素）抗性的重组质粒，例如pPICZalpha;A，B，C系列的载体。在筛选X-33重组转化菌株时，Zeocin抗生素的工作浓度是100ug/ml。X33毕赤酵母含有AOX1基因，产生的转化株是Mut 基因型。如本文也采用X-33毕赤酵母来表达FXIota;CD。
FXI CD域具有序列较短，结构相对简单，且易于表达，理论上会比完整FXI更加稳定，保存时间更长，保存条件相对于FXI没有那么严格等优点，本产品是FXI 的理想替代品，在以FXI为靶点开发新型抗凝剂的科研实验中不可或缺，且难以替代。针对于FXI 在国内可及性不佳这一特点，本实验使用重组表达的方法制备FXI CD并表征其各项理化性质。如果可以开发出FXⅠCD这种科研试剂,将是一项重大突破。
二、研究手段
通过毕赤酵母X33酵母表达FXIota;催化区，加入甲醇诱导表达，通过离心，硫酸铵沉淀法，以及亲和层析法并将其分离并纯化，得到较为纯净的产物，用电泳法验证，然后通过生色底物法比较其与FXIota;催化活性的差异。
- 研究内容
委托公司从而获得含有His标签和目的基因FXI CD的pPICZalpha; A重组质粒载体和穿刺菌，目的是进行后续的电转化和FXⅠCD的表达。
将穿刺菌进行培养，提取质粒，并将其线性化切割，用核酸电泳来验证。并进行电转化，在含有抗性的平板上筛选，目的是得到阳性转化子。
预实验：在平板上挑取单菌落，镜检，保菌接入培养基培养，获得上清发酵液，超滤浓缩，SDS-PAGE电泳的目的是检测是否出现目标分子量的条带，酶活研究，目的是检测其有无活性，是否可以进行后续大量表达。
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