开题报告
题目：苯乙双胍对TGF-beta;1－Smad3通路的作用
- 立题目的
转化生长因子（TGF-beta;）超家族,是一种多功能蛋白，它控制许多细胞的反应，比如细胞增殖，分化，细胞外基质重塑的等等[1] TGFbeta;1是TGFbeta;的其中一种亚型，是目前研究最多的与器官纤维化发生的细胞因子[2]，在分子机制上，TGF-b1介导异源丝氨酸/苏氨酸受体复合物通过Smad信号通路，导致ECM的沉积，从而发生纤维化[3]。而Smad3在促进胶原I型合成，从而发生纤维化有重要作用[4]，本实验组研究发现，二甲双胍可通过抑制TGF-beta;1–Smad3信号通路，从而抑制心脏成纤维细胞的胶原合成，来抑制心脏纤维化[5]。苯乙双胍虽然与二甲双胍同为双胍类药物，但二者在化学结构上存在显著差异，其中苯乙双胍在胍的侧链上存在着苯乙基环,有更好的脂溶性[6]，本课题研究目的是明确苯乙双胍对Smad3磷酸化的作用，可为阐明双胍类药物对TGF1 －Smad3的机制奠定基础，提供实验依据。
- 立题依据
本实验室前期工作，利用TGF-beta;1制备小鼠心肌纤维化模型，采用浓度不同给药模式，分别检测二甲双胍对Smad2与Smad3磷酸化的作用。发现出，二甲双胍对TGF1引起的Smad2磷酸化无影响，但可以抑制Smad3磷酸化。这一结果提示，二甲双胍可以抑制TGF1引起的核蛋白Smad3（磷酸化和总蛋白）增加，二甲双胍抑制TGF1引起的Smad3转位入核，从而得出二甲双胍对TGF-beta;1－Smad3通路有抑制作用。进而抑制心脏纤维化，改善心脏重塑的作用等[5]，经目前的研究， TGF-beta;1－Smad通路是与细胞外基质沉积的关系最为密切，被公认为器官纤维化的治疗靶点[7]也是导致上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition）[8]，进而促进肿瘤，的通路之一[9]，TGF-beta;1有三个基本方向：一、可以调节细胞增殖，生长，分化和细胞运动。二。具有免疫调节作用。三、调节胶原生成和组织修复，有促进纤维化的作用[10] [11]。Smads家族是细胞内信号分子的行动对转化生长因子受体下游（TGF）-beta;家族的配体[14]。 细胞内的效应TGFbeta;1信号转导，使受体激活型Smad2/3磷酸化，并与通用型Smads Smad4结合[15] [16] 通过受体激活转运到细胞核中，启动基因表达。[17]而Smad3是心肌梗死后纤维化重塑的必要信号因子，[12]它是唯一具有DNA结合和转录激活结构域的Smad，因此也是最有可能直接参与基因表达的Smads，[13]抑制Smad3磷酸化，可以进而抑制TGF-beta;1－Smad通路产生的纤维化、肝硬化、癌症等疾病。
综上所述，本课题提出的假说是苯乙双胍可通过抑制Smad3的磷酸化来抑制TGFbeta;1-Smad3通路，来抑制纤维化的产生。
- 研究内容
小鼠成纤维细胞（3T3）为成纤维细胞，在成纤维细胞中，TGFbeta;1细胞内介质的信号由Smad2和Smad3来调节，[13]为此，研究苯乙双胍对TGF-beta;1Smad3通路的作用，需要将苯乙双胍梯度稀释并加同浓度的二甲双胍做对照。因此，本课题计划选不同浓度的苯乙双胍，同时间加药一段时间后，加入TGF-beta;1并分别观察，并证实苯乙双胍可抑制Smad3的磷酸化；并进一步论证双胍类药物对TGF-beta;1－Smad3通路的作用。
- 研究方法
选取3T3（小鼠成纤维）细胞进行培养，撤血清，不同浓度的苯乙双胍与二甲双胍刺激，裂解细胞，收样，采用BCA蛋白定量技术，检测不同的样品中的蛋白浓度，然后进行Western-blot实验，检测经过刺激后细胞中p-Smad3和Smad的表达量，最后通过发光得到的胶片，观察实验结果，进行分析总结
- 研究计划
- 选取3T3（小鼠成纤维细胞）并用不同浓度的phenformin（苯乙双胍）给药刺激一小时后，分别加5ng／ml的TGF-b1后一小时，收集细胞和上清液，做western blot
- 用二甲双胍相同浓度的做对照,重复实验。
参考文献
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