开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、实验背景
近年来，细菌耐药性特别是革兰氏阴性菌的耐药性已成为危害人类健康的重大威胁，目前临床上极度缺乏安全有效的治疗多药耐药革兰氏阴性菌感染的药物。2017年，世卫组织根据对新型抗生素的迫切需求程度将耐碳青霉烯类药物的鲍曼不动杆菌（CRA）、绿脓杆菌和产超广谱beta;-内酰胺酶（ESBLS）的肠杆菌科（CRE）列为极为重要的三种细菌，而这三者均为多药耐药性革兰氏阴性菌。因此研发新型抗多药耐药革兰氏阴性菌药物是临床上十分迫切的巨大需求。然而，细菌产生耐药性的机制众多，故研发全新结构骨架的和作用机制的化合物是解决耐药问题的最直接手段。因此本研究使用重组酵母双杂交技术对化合物库进行高通量筛选，以期发现新机制的靶向先导化合物。
二、选题依据（文献综述）
革兰氏阳性细菌和阴性细菌结构的一个重要区别就是革兰氏阴性细菌具有独特的beta;-桶状结构外膜蛋白（OMPs），OMPs在细菌生命活动中起着多种至关重要的作用，而BAM复合体（又称外膜蛋白装配因子）是影响外膜蛋白装配的关键。2016年刊登在Natuer上的BAM复合体的完整结构表明：BAM复合体由五种蛋白组成。Knowles等把这些蛋白命名为BamA、BamB、BamC、BamD、BamE[1]，且研究表明这些蛋白与OMPs的装配相关。基因敲除和突变实验证明 Bam A 与 Bam D两者之间的相互作用在细菌外膜的生物合成中起到关键作用，当其功能受到破坏时，细菌无法存活[2 -3] 。目前，研究集中于 BAM 复合体结构与功能的解析，并没有蛋白相互作用阻断剂的相关报道，故以此为靶点可能发现全新机制的抗革兰氏阴性菌化合物，避免与现有药物交叉耐药。
酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)自建立以来已经成为分析蛋白质相互作用的强有力的方法之一。双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明,转录激活因子在结构上往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有 DNA 结合结构域(binding domain, 简称为BD)和转录激活结构域(activation domain,简称为AD),它们是转录激活因子发挥功能所必需的[4]。一个双杂交系统，BD与X蛋白融合为诱饵蛋白，AD与Y蛋白融合为猎物蛋白，如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物，则会启动报告基因序列的转录。我们可以通过对报告基因的检测判断诱饵和猎物间的相互作用，反过来可判断药物对诱饵和猎物间的相互作用是否存在阻断作用。因此，利用此种技术可以寻找能够阻断蛋白质间相互作用的先导化合物，从而设计并产生新的抗菌药物。
酵母双杂交系统由于具有敏感性、简洁性、真实性和广泛性等优点而被应用到许多方面的研究，但该系统还是有它自身的局限性的[5]。其中最重要的就是假阳性（没有发生相互作用就能引起阳性反应）和假阴性（某些蛋白不适合该系统而引起阴性反应）。所以，往往需要结合其他手段来排除假阳性和假阴性[6]。
GST-pulldown技术自从1988年Smith及其研究团队纯化出带有GST标签的融合蛋白后，逐渐成为体外研究蛋白间相互作用的主要手段，研究中常利用这种技术在体外证明蛋白间存在直接作用关系[7-8]。GST能与谷胱甘肽特异性结合，其作为表达标签蛋白，能促进表达蛋白的正确折叠及可溶性表达［9］。故以带GST标签的蛋白质从分子水平检测蛋白质间的相互作用可以有效地排除部分假阳性情况。同时，根据文献报道，当 BAM 复合体功能被抑制时，膜蛋白OMPs将无法正常折叠装配[10]。我们可以通过检测折叠成功与未成功的Omp C 蛋白含量评价 BAM 复合体的功能受到抑制的情况，进一步排除假阳性和假阴性情况，并深入探究BAM复合体参与膜蛋白装配及活性化合物阻断装配的机制。
三、拟研究或解决的问题
（1）利用酵母双杂交技术构建BamA与BamD蛋白相互作用的模型并验证，以此模型联用大肠杆菌标准株筛选对BAM靶点具有阻断作用的先导化合物。
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