神经细胞缺氧缺糖损伤模型的建立及药物筛选文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

拟研究的问题：

构建神经细胞缺糖缺氧模型并通过此模型筛选两种药物研究药物是否对神经缺糖缺氧模型损伤的细胞有保护作用或减轻氧糖剥夺所致神经细胞损伤的作用。

采用的研究手段：

1. 绘制神经细胞的生长曲线

2. 分别对PC12细胞及离体脑片构建缺氧缺糖模型，观察该模型对神经细胞及脑组织的损伤。

3. 选择两种药物对PC12细胞及离体脑片缺氧缺糖模型进行药物干预，通过MTT法和TTC染色判断细胞和脑片的损伤程度及药物的影响

4. 通过流式细胞术检测细胞内活性氧水平

神经细胞内 ROS 水平采用荧光探针 2,7 - 氯荧光黄双乙酸盐（即DCFH - DA）进行检测，DCFH-DA是一种用于检测活性氧的特异性荧光探针。具体操作步骤如下：将HT22细胞消化计数，以 2105 个/孔加入 6 孔板中培养过夜，待细胞进入对数生长期，按2.1的缺氧缺糖造模方法进行造模。将原始浓度为 10m M 的 DCFHDA 用无血清 DMEM培养基按 1：1000 比例稀释成 10 mu;M 终浓度工作液，将6孔板中的培养基弃掉，加入提前配制好的终浓度为10 mu;M DCFH-DA 探针，置于 37 C、含有 5%的 CO2 的培养箱中避光进行孵育 30 min。之后将细胞用胰酶进行消化，用不含胎牛血清的DMEM进行洗涤，以 250 g离心力进行离心，每次 5 min，重复洗涤三次。立即采用流式细胞术以激发波长488 nm 和发射波长 525 nm 对每个处理组中 1 105 个细胞内 DCF 荧光强度进行检测。

文献综述

脑梗死，又称缺血性脑卒中，是各种原因所致脑部血液供应障碍，导致脑组织缺血、缺氧性坏死，出现相应神经功能缺损。脑梗死是神经系统的常见病及多发病，是目前导致人类死亡的三大主要疾病之一。因此，缺血性脑卒中成为神经系统疾病的研究热点。目前离体实验常用模型为缺氧缺糖模型（OGD）。

目前FDA批准的唯一一个治疗脑梗死的有效药物是组织型纤溶酶原激活物，可见治疗脑梗死的有效治疗方案非常之少。因此，对缺血性脑卒中的深入研究及寻找有效的治疗药物至关重要。而研究的关键在于模拟脑梗死导致的缺血缺氧功能损伤型细胞，目前常用的离体实验模型为缺糖缺氧模型（OGD），通过剥夺细胞的营养供应及氧气来模拟人体脑梗死，它是目前模拟人体脑缺性卒中的经典离体实验模型。此外脑损伤是法医学鉴定工作中常见的损伤类型，脑损伤发生后的继发性神经细胞损伤的分子机制一直为各国学者所关注。以往关于脑损伤研究的模型存在脑损伤的力学特点不规则，同样的力造成不同动物脑损伤程度不一致及损伤影响范围不易控制等问题。而原代培养的神经细胞样本较均匀，可以较好地控制损伤方法和损伤程度，损伤后观察和检测也比较方便，尤其在进行某些损伤机制方面的研究有其明显的优越性，因此制作合适的神经细胞损伤模型对研究颅脑损伤的机制也具有重要意义

药物筛选的研究结果：

在前期研究中许多现代药理研究表明黄连素对脑IR损伤具有神经保护作用。

1. 黄连素可抑制OGD-R损伤所致的PC12细胞活力降低

2. 黄连素可抑制OGD-R损伤所致的PC12细胞凋亡

3. 黄连素可抑制OGD-R损伤导致的PC12细胞ROS生成增加。

4. 黄连素抑制OGD-R损伤导致的PC12细胞线粒体细胞色素c和AIF的释放。

结论：黄连素可减轻氧糖剥夺所致PC12细胞损伤，其机制与其抑制ROS（细胞活性氧族）生成、减轻促凋亡蛋白细胞色素1C和AIF释放，进而阻断线粒体通路1的细胞凋亡有关。即黄连素对PC12细胞1氧糖剥夺损伤具有显著的保护作用，机制与抗氧化应激有关。

研究表示在小鼠离体脑片及大鼠皮层神经元OGD/PR损伤模型中，发现黄芩苷有明显的保护作用，表明黄芩苷确实有抗神经元缺血性损伤的作用。其作用可能与抗自由基有关。

细胞凋亡与脑缺血损伤关系密切，且在缺血的发生、发展过程中发挥着重要作用，早期进行抗凋亡治疗对抗脑缺血损伤具有重要的意义。Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其 中 Caspase-3 为 关 键 性 执 行 分 子，降 低Caspase-3的活性能够有效 抑制凋亡的发生发 展。已有文献报道 OGD损伤能够激活 Caspase-3蛋白的表达，本实验证实 10％ 的含药血清对损伤的PC12细胞保护作最为明显，倒置显微镜下观察，细胞形态接近正常；Hoechst染色结果表明细胞凋亡数减少；Western blot结果显示，10％含药血清能够抑制 OGD诱导的促凋亡蛋白 Caspase-3表达的上调。这些结果表明，桃红四物汤能够对抗脑缺血引起的神经细胞凋亡，具有神经保护作用。

参考文献

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