- 课题现状及研究进展
- 课题现状：
混合谱系白血病蛋白（MLL）家族中的MLL1是一种区别于其他家族成员的甲基转移酶。具体来说，它催化组氨酸3赖氨酸4（H3K4）甲基化。研究者们发现1，在急性髓性白血病和急性淋巴性白血病中，MLL1常常被错误地调节，其中最常见的是11号染色体的易位导致MLL1与其他蛋白形成一种蛋白复合物(MLL1, RbBP5, Ash2L, WDR5, DPY-30)，从而使HOXA9和MEIS1被激活。HOXA9和MEIS1是参与造血细胞自我更新的重要基因，两基因的表达通常是下调的，所以当基因被激活，就会诱发急性白血病。有数据显示，MLL1的错误表达见于5 - 10%的成人急性髓系白血病的和近70%的婴儿急性淋巴性白血病。2而目前这些伴随有MLL蛋白异常、11号染色体易位的急性白血病患者的治疗和预后效果都非常差。因此，迫切需要开发新的和有效的治疗药物来治疗MLL白血病。
据报道3MLL1蛋白的H3M4甲基转移酶（HMT）的活性是诱发白血病所必需的，所以，研究目光自然被集中在如何抑制MLL1蛋白的H3M4甲基转移酶的活性。当MLL1蛋白独自存在时，HMT活性较低，而形成MLL1蛋白复合物后，HMT活性会显著提高，所以抑制MLL1与其他几种蛋白的相互作用成为一种可行的研究策略。
在几种可与MLL1形成复合物的蛋白质中，我们将把研究方向放在抑制WDR5与MLL1的结合上，这样考虑的因素如下：首先，WDR5 – MLL1相互作用对MLL1复合物的稳定性和MLL1复合物的HMT活性起着关键性作用。第二， MLL1中优先与WDR5相互作用的12个氨基酸残基——WIN肽(残基3762minus;3773)已经被定位，有研究表明4在体外，WIN肽可以促进MLL1复合物的解离，从而抑制HMT活性。这为小分子抑制剂的设计提供了一个良好的起点。第三， WIN肽的精氨酸3765与WDR5蛋白的精氨酸结合囊结合，而组蛋白H3与WDR5蛋白相互作用使用的是同一个精氨酸结合囊4，从而影响HMT活性。所以有了WIN肽的研究基础，抑制WDR5 – MLL1相互作用成为了药物设计的主要思路。
- 研究进展：
研究者发现5MLL1中与WDR5结合具有高亲和力的最短片段为-CO-ARA-NH-序列，并且有两个氢键（1.在-1位的丝氨酸羰基氧和3位丙氨酸的酰胺氢之间，2.在1位丙氨酸的羰基氧和4位谷氨酸的酰胺氢之间）对维持高亲和力起到了关键作用。之后对H3-WDR5相互作用进行研究，已知H3与MLL1结合WDR5的方式是相似的（H3有与MLL1中ARA相似的ART），但H3亲和力更低。对H3进行结构改造发现，如果对A1游离氨基乙酰化，会大大提高对WDR5的亲和力。（Ac-H3-3mer是原来的1500倍，Ac-H3-10mer甚至达到原来的10000倍)原因很容易得出：未经乙酰化会导致氢键1的结构缺失，从而导致亲和力较低。最后，为了对亲和力进行准确测定，研究者们进行了荧光标记肽的设计，最初使用WIN肽设计出两种标记肽——WIN- fam -1和WIN- fam -2（fam是荧光素）后又根据-CO-ARA-NH-和乙酰化的H3设计出10mer-Ala-FAM和10mer-Thr-FAM。这其中，10mer-Thr-FAM的活性最好。
研究者预测了-CO-ARA-NH-与WDR5结合的模型，发现基本上可划分为五个结合口袋P1-5。通过对五个结合口袋部分的基团进行修饰，我们发现：1.P1口袋中最适合结合的基团是2-氨基丁酸（2-Abu）或Val。2.P2口袋狭长，也是关键位点，最适合插入Abu的乙基侧链。3.以Ac-XRV-NH2为模板，改变疏水性，以进一步提高P1、P4的结合强度，通过连接一构象受限的环烷基得到这一阶段最佳化合物4b 4.接下来，对Ala3进行类似修饰，得到6a,6d。5.对C端、N端的进一步烷基修饰，分别对应P3和P5两个小疏水空腔，得到修饰后化合物7a、8g。将以上各个部分的结构优化综合起来得到化合物MM-101和他的氟代物MM-102，对其进行共晶复合物测定，发现结合模式与预测情况基本吻合。接下来测定化合物对HMT活性的抑制（采用闪烁计数法，将放射性甲基掺入H3中），MM-102活性良好。再测定它是否能够抑制HOXA9和MEIS1基因的表达，结果仍然令人满意。6
已知一种被报道的苯酰胺类化合物是MLL1-WDR5相互作用的强效抑制剂，通过蛋白质晶体结构的测定来指导逐步的结构优化，合成了更有效的抑制剂177。
同样是以苯酰胺类化合物为基础，通过改变C-1苯甲酰胺和C-5取代基进行结构优化。首先通过WDR5-4的共晶结构（PDB-3SMR）初步筛选了一批化合物，得到结合良好的化合物5。同样方法对WDR5-5（PDB-4IA9）研究发现，酰胺键和4-甲基哌啶与WDR5形成了关键的氢键，不可更改。接下来，将目光放在C-5和苯环取代基的改造。WDR5-5中可观察到，C-5硝基与F133、Y191和P173形成良好范德华力，在保留这种相互作用下进行结构改造，引入大体积的芳香族侧链，结果显示 C-5位置引入一个双环的杂环，与邻近的Y191、F149、F133残基侧链增加了相互作用，最终产生更强的结合亲和力。但是，这些杂环的引入会降低化合物的溶解度，而在C-5上引入吡咯烷和以吗啡取代苯环的方法可以解决这一问题。由此产生的化合物9p-t亲和力良好同时其溶解度问题得以改善。接下来进行苯甲酰胺取代基部分改造，我们发现取代基部分与蛋白无氢键连接，其附近的D107成为改造后氢键可能连接的残基。设计大量化合物，通过分子对接筛选，亲和力测定，最终活性相较之前无显著提高。将苯酰胺环中苯环用杂化替代，设计合成筛选，得到最佳化合物14a(酰胺羰基连接4-三氟甲基吡啶酮基)，再参考之前的C-5修饰，得到高活性化合物16d，这为之后的生物标记物和小分子抑制剂的设计提供良好的基础。WDR5-16d (PDB- 4QL1) 中观察到新引入的取代基吡啶酮的氮与D107侧链形成直接的氢键。1
针对MLL1-WDR5靶点，在发现一些短肽或者苯酰胺类小分子抑制剂之后，研究者们又发现了环肽化合物MM401、MM-589。在对MM-101结构改造过程中，发现一种环肽化合物MM-401，通过FP检测得知，MM-401的亲和力 约是MM-101的700倍。MM-401具有特异性，选择性抑制MLL1的HMT活性且不影响MLL家族其他HMT活性。文献中还做了一系列生物评价，指出其对人的急性白血病有一定治疗效果，具有成药潜力。8之后将MM-401进行结构改造，根据共晶结合特点，改变取代基和整个环肽的大小，最终得到化合物18（MM-589）（文献发表时，最有效的WDR5 – MLL1抑制剂）。此外文章还指出了一种新的HMT活性测定方法(以核小体为底物)。3
2. 拟研究的问题
设计合成全新骨架WDR5 – MLL1相互作用小分子抑制剂，并通过筛选得到先导化合物。
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