重组Ta1-Fc-iRGD融合蛋白的制备及其活性研究文献综述

 2022-12-29 14:09:11
  1. 课题背景

近半个世纪以来，肿瘤逐渐成为世界各国主要的公共卫生问题，发病率及死亡率呈现逐年上升趋势[1]，传统的手术和化疗费用昂贵且对人体伤害较大。

胸腺肽（thymosin）是一种重要的免疫调节剂，胸腺肽alpha;1（Talpha;1）[2]是胸腺肽的主要活性成分。作为一种重要的双向免疫调节剂，Talpha;1调节免疫反应的作用机制主要是通过T细胞实现[3]，包括增加T细胞的产生(CD3 、CD4 、CD8 细胞)、刺激T细胞分化与成熟、减少T细胞凋亡以及产生T细胞介导抗体等[4]。此外，Talpha;1通过调节炎性细胞因子 (IL-2、IL-3、IL-6、IL-7等)和干扰素alpha;（IFN-alpha;）、干扰素beta;(IFN-beta;)的释放，促进自然杀伤细胞（NK）和树突细胞分化成熟[4]。Talpha;1的抗肿瘤作用体现在，Talpha;1是一种多肽类物质，能促进机体内淋巴细胞生成，进而调节T细胞亚群比例，并且促进B细胞分化和产生抗体，增强巨噬细胞的吞噬功能，最终改善肿瘤患者的细胞免疫系统功能[4]。Talpha;1具有呈递抗原的作用，在肿瘤产生时可增强免疫应答和诱导肿瘤细胞凋亡[5],现已在肿瘤临床治疗中广泛应用。如Talpha;1可用于行根治性手术治疗的原发性肝细胞癌患者术后辅助治疗[6]；用于晚期胃癌患者的治疗[7]；Talpha;1联合化疗可以明显提高患者的免疫功能水平、改善化疗期间的生活质量。

如何提高Talpha;1的抗肿瘤活性一直是研究的难题，因其缺乏肿瘤靶向性，同时复杂的肿瘤微环境使抗肿瘤药物常难以渗透至肿瘤组织深部，导致生物利用度低。同时，其还存在着血浆半衰期较短的问题，Talpha;1易被降解失活，体内半衰期短于2h[8]，阻碍了Talpha;1在肿瘤治疗领域的全面应用。

有研究显示，将Talpha;1与人IgG4的Fc片段融合，增加了其相对分子质量，避免被肾小球滤过，从而延长其循环半衰期[9]。抗体的Fc段与抗体的效应功能有关，抗体Fc工程通过对抗体分子Fc段结构和功能的研究，有计划地对其基因序列进行改造，改善抗体的功能。抗体Fc段与新生儿Fc受体（FcRn）的相互作用是pH依赖的：在低pH下具有高的亲和力，但在生理pH（pH~7.4）条件下无法结合[10]。当Fc融合蛋白药物进入血液循环时，血管上皮细胞胞外环境无法使FcRn与Fc结合，Fc融合蛋白药物以胞吞方式进入细胞，形成酸性囊泡，Fc和囊泡膜上的FcRn特异性结合，结合的药物能避免溶酶体的降解。当再次转运至细胞膜时，由于胞外pH约为7.4，所以Fc与FcRn分离，药物又被释放回血液中[11]。如此，通过FcRn介导的循环机制可以有效延长融合蛋白的半衰期，从而减少用药频率，降低成本。

有研究表明，通过添加肿瘤穿透肽iRGD片段[12]（Cys-Arg-Gly-Asp-Lys-Gly-Pro-Asp-Cys）可以增加Talpha;1对癌细胞的抗增殖活性与肿瘤穿透能力，使药物精准地到达肿瘤部位，Talpha;1-iRGD融合肽[12]的研究为Talpha;1治疗实体瘤提供新的途径。靶向治疗指设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞[13]。在肿瘤血管生成过程中，血管内皮细胞特异性地高表达某些整合素受体，如avbeta;3受体，而正常组织血管中含量较少。研究证实含RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）的序列肽段可以与肿瘤血管内皮细胞上高度表达的avbeta;3、avbeta;5受体特异性结合，且经RGD修饰的载体可以将药物靶向投递到肿瘤血管处[14]。氨基酸C-端序列为R/KXXR/K的短肽是肿瘤组织内高表达的神经纤毛蛋白-1(NRP-1)受体的特异性配体。将“氨基酸C-端序列为R/KXXR/K”的位点效应称为C-端法则(CendR)，CendR序列和NRP-1的相互作用是药物克服生理屏障，促使其在肿瘤组织内穿透的最关键因素[15]。iRGD可以与avbeta;3整联蛋白结合，通过蛋白水解从而暴露出其CendR序列，该序列进而与癌细胞表面高表达的NRP-1结合，所以经iRGD修饰后的药物能够更好地在肿瘤部位聚积，显著提高药物在肿瘤实质内的穿透能力，促进药物分布到血管外的肿瘤细胞，从而达到更有效、精确和安全的治疗目的。

  1. 实验目的和意义

本实验中我们将胸腺肽alpha;1（Talpha;1）与人IgG4的Fc片段、iRGD融合表达。经iRGD修饰后的Talpha;1与Talpha;1相比，增强了其抗肿瘤活性与特异性，能够使药物更精准地到达肿瘤部位并穿透至肿瘤内部，减少对正常细胞的损害。将Talpha;1与人IgG4的Fc片段融合，增加了其相对分子质量，避免被肾小球滤过。抗体Fc段可以与FcRn结合，延长其循环半衰期，以此提高抗体药物疗效，减少给药剂量。希望通过本次研究，探索Talpha;1-Fc-iRGD融合蛋白对于肿瘤治疗的作用。

  1. 实验内容

本课题内容可分为以下三个部分：

  1. Talpha;1-Fc-iRGD和Fc-iRGD融合蛋白的诱导表达

使用大肠杆菌原核表达系统，探索最佳诱导条件（诱导剂IPTG最佳浓度和最佳诱导时间），探索融合蛋白是否可溶性表达。

  1. Talpha;1-Fc-iRGD和Fc-iRGD融合蛋白的分离纯化

经IPTG诱导，超声破碎仪破碎菌体，镍柱纯化，Sephadex G25凝胶层析柱脱盐，冻干机冻干，通过SDS-PAGE凝胶电泳检测Talpha;1-Fc-iRGD和Fc-iRGD融合蛋白纯度。

  1. Talpha;1和Talpha;1-Fc-iRGD融合蛋白的活性研究

利用LLC小鼠肺癌细胞构建小鼠肿瘤模型。使用90%的1640培养基培养肿瘤细胞，完全培养基含10%的血清和1%的双抗。将0.1 mL（活细胞浓度 1times;105—1times;107个/mL）LLC小鼠肺癌细胞悬液异位移植到小鼠前肢腋下，同时设立空白组小鼠，相同部位注射等量生理盐水，进行体内抗肿瘤活性研究。

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