开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、课题的研究背景以及解决的问题
1. 研究背景
胰腺癌是全球最为致命的恶性肿瘤之一，在发达国家胰腺癌致死率在癌症相关死亡中排名第四是一类极具破坏性的恶性疾病，其中位生存期为3-6个月，5年生存率低于5%[1-4]。胰腺癌缺少有效的早期诊断技术，加之其对放射线疗法耐受性差，使得胰腺癌患者预后效果很差，找到新的高效的早期诊断生物标志物极其重要。
随着肿瘤研究的不断进展，人们发现并不是所有的肿瘤细胞都能够无限增殖。在1983年，Mackillop等[5]提出了肿瘤发病机制的新假说，即肿瘤组织内存在不同分化阶段的细胞，其中极少部分具有干细胞特性。这一亚群细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，在癌症的复发和耐药过程中发挥重要作用，被称为“肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）”[6]。这一假说在血液系统肿瘤中被首次证实[7]，随后在结肠癌、肺癌、乳腺癌和肝癌等多种实体肿瘤中也被发现CSCs的存在。Li等[8]首次对胰腺癌干细胞（Pancreatic cancer stem cells，PCSCs）作出研究，并从胰腺癌组织中成功分离出具有干样特性的癌细胞，植入小鼠模型中，验证了其高致癌的特性。
PCSCs同其他肿瘤干细胞一样，具有多个特定的表面标记物，如CD44、CD24、ESA、CD133、ALDH-1等[8-10]。在PCSCs研究中，CD44 CD24 ESA 三阳性细胞或CD133 阳性细胞通常被认为是具有干样特性的癌细胞，该类细胞在整个胰腺癌组织中比例极低，利用表面标记物分子对细胞进行分选得到PCSCs的方法效率较低，样本取材不便，很多研究者根据CSCs的生物学特性，采用不同的方法来富集CSCs。例如，依据CSCs具有化疗药物耐受的特性，可用低浓度给药法筛选富集肝癌干细胞（LCSCs）[11]；CSCs具有自我更新的能力，在低粘附培养环境下，单个CSC细胞可生长成为细胞球，普通癌细胞无法存活，也能够实现CSCs的富集[12]，但是悬浮培养体系富集CSCs，可能是由于细胞自身的运动能力而引起非特异性聚集，因此该方法备受质疑。开发建立一种高效的体外CSCs培养体系这一问题亟待解决。
实验室在前期创造性的用甲基纤维素作为半固体的骨架，并添加一系列的细胞因子，在低粘附板中建立三维半固体培养体系，该体系成分明确，具有良好的可重复性。人胰腺癌细胞Panc-1单细胞悬液在该体系中培养11天后可形成三维立体的球状集落，该球体大大提高了CD44 CD24 ESA 三阳性细胞比例，并具备胰腺癌干细胞相关标志。为了进一步确认该球体细胞的干细胞特性，采用连续传代法验证了该球体细胞的自我更新能力，将其进行贴壁培养后，观察其形态变化及相关干细胞标志物，证明球体细胞的多分化潜能。体内裸鼠植瘤实验验证了球体细胞的高致瘤性。这表明我们可以利用该三维半固体培养体系成功富集具有干细胞特性的Panc-1细胞。
人类基因组中，只有少量基因能够编码蛋白，大部分基因只发生转录过程，因此在转录组中存在大量不具有蛋白编码能力的非编码RNA，包括微小RNA（miRNAs）、长链非编码RNA（long noncoding RNAs，lncRNA）等，其中近80%为lncRNAs。高通量测序，也被称作二代测序，可以检测分析整个人类基因组中的遗传突变，已被广泛地用于基因转录组的研究[13]。LncRNAs长度一般大于200nt，并不具备完整的开放阅读编码框，没有编码产生完整蛋白质的能力[14]。研究显示lncRNAs能够参与侵袭迁移、细胞凋亡等生物学过程，在胰腺癌中多种lncRNAs表达发生改变，如lncRNA HOTTIP、NORAD、XIST、H19、MEG3、MEG9等，它们通过不同方式调控基因表达，参与胰腺癌的多种生物学过程。
MEG3是研究较早的一个lncRNA，报道显示MEG3可作为肿瘤抑制因子包括胰腺癌，能够通过上调p53，促进胰腺癌细胞凋亡，抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移能力及上皮间质转化（EMT）过程[15,16]，MEG3作为母系表达基因，在多种癌症中有广泛研究，且与癌细胞的生物学功能密切相关。前期工作也发现MEG9在癌细胞中表达下调，但MEG9作为其同源家族，在文献中却少有报道。
- 课题解决的问题
深入研究lncRNA对胰腺癌肿瘤干细胞生物过程的调控作用及其机制，能够为探索胰腺癌的发病机理和挖掘新的治疗靶点提供指导和借鉴。故本课题对胰腺癌干样细胞进行如下研究：（1）MEG9在胰腺癌组织、细胞中的表达情况;（2）MEG9在胰腺癌细胞中的定位和功能。
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