开题报告内容:(包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述,不少于2000字)
课题背景:
多糖是天然大分子物质,是生命有机体的重要组成成分和维持生命所必需的结构材料,广泛存在于植物、动物、微生物中[1] 。糖类的生命科学已有近百年的历史,几乎与蛋白质的生命科学同时诞生[2]。但糖类研究却远远落后于飞速发展的蛋白质和核酸的研究。之所以如此,有两个重要原因:一是理论上的简单化,科学工作者认为糖类不过是一种能源和细胞内支撑物;二是在研究方法上较困难,从自然界分离的粗多糖是非常复杂的混合物,其中包括各种生物大分子的混合,不同多糖(包括中性多糖、酸性多糖、杂多糖)的混合以及不同分子大小、不同糖苷键构成的多糖的混合,因此必须采用适合其结构特点的方法进行分离、分级和纯化。多糖结构的复杂性也大大增加了多糖研究的难度[3]。
海胆黄多糖(polysaccharidefrom the eggs of Strongylocentrotus nudus,SEP)是本实验室自主从光棘球海胆中分离纯化得到的均一多糖组分,相对分子质量在1950k左右[4],研究发现[5~9]:SEP在体内刺激淋巴细胞增殖,促进细胞因子分泌,抑制S180实体瘤、H22肝癌生长,具有显著的免疫活性和抗肿瘤活性,具有较广阔的应用前景。为了更好的对其进行临床前研究和开发利用,迫切需要改进分离纯化技术和规模,获得高产率高纯度的海胆黄多糖。
目前,以海胆为原料,提取纯化海胆黄多糖的小试工艺已经较为成熟[5],海胆黄经过丙酮脱脂,热水提取、去蛋白、醇沉、超滤、DE52和Sephacryl S-400柱层析纯化得SEP精品。在提取过程中,反复多次用Sevag法除蛋白,试剂消耗多、毒性大,且多糖损失较多。另外,在小试过程中采用旋转蒸发仪减压浓缩,透析袋去除小分子杂质,这二者处理能力有限,不适合中试生产。因此,需要对其过程进行改进和优化,以适合大规模分离纯化的需要。
由于酶法条件温和,降低杂质蛋白质含量的同时能保证较高的多糖回收率[10],故本实验拟采用木瓜蛋白酶联合Sevag法除蛋白,探讨酶法除蛋白的最佳条件(木瓜蛋白酶用量和酶解时间)。另外,超滤法[11]具有处理量大、操作简单、无相变、利于保持生物活性等特点,能够节约生产时间和成本。因此本次实验以超滤法替代减压浓缩和透析去除杂质,确定超滤压力、原液浓度、浓缩倍数等超滤过程参数。本实验旨在通过对海胆黄多糖SEP分离纯化工艺的研究和优化,获得高产率高纯度的SEP,为规模化制备SEP奠定基础。
实验流程:
1. 海胆黄粗多糖的制备
1.1木瓜蛋白酶除蛋白最佳条件的确定
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