文献综述：
摘要：Noscapine是从植物中提取的四氢异喹啉类生物碱，是一种抗肿瘤活性高、作用机制独特且毒副作用小的新型抗肿瘤药物。但该类植物天然产物一方面由于含量稀少而难以提取，另一方面由于结构复杂而难以合成，因而限制了其大规模生产。近年来，随着基因组学与合成生物的迅速发展，利用染色体编辑技术将这类化合物的合成基因簇整合到微生物染色体以进行生物合成的策略，为突破复杂植物天然产物生产瓶颈开辟了新的途径。为此，本文以Noscapine为例，从植物基因簇生物信息学分析、基因组大片段克隆、染色体编辑以及酵母表达这四个方面系统地综述了植物天然产物的合成生物学研究。
植物次生代谢的概念最早于1891年由德国化学家Kossel提出，次级代谢产物是由糖类、脂类、核酸和蛋白质等初生代谢产物经一系列酶促反应转化而成的结构复杂的小分子有机化合物。植物次生代谢产物根据其基本结构特点可分为萜类、酚类和含氮化合物三大类，它们不仅广泛在植物生命活动过程中发挥着重要作用，而且是药物的主要来源，如生物碱类 , 萜类化合物 、苷及皂苷类 、黄酮类 、多糖类 、香豆素及木脂素类以及维生素等[1]。目前制药工业的来源仍以植物天然产物为主，但大多天然产物化学结构复杂，合成效率较低，提取与分离较困难，并且难以通过化学方法合成，因此利用合成生物学方法进行植物次生代谢产物的合成是一项具有潜力的技术。
随着基因测序技术、基因组学和生物信息学的飞速发展，利用微生物宿主合成天然产物的策略已被广泛应用。大肠杆菌和酵母是最常用的表达宿主，这些微生物具有优良的生长性能和完善的基因操作工具。自Pfeifer 等人2001年利用大肠杆菌异源合成出复杂聚酮类抗生素以来[2]，微生物异源合成次生代谢产物的研究发展十分迅速。2012年，Nakagawa等利用大肠杆菌合成苄基异喹啉类生物碱的前体分子(S)-牛心果碱的研究已取得成功[3,4]；2013年，Keasling等在酵母中高效合成了青蒿素抗疟药前体青蒿酸[5]；2014年，Fossati等在酿酒酵母中成功重建了二氢血根碱合成路径[6]。这些例子表明了利用微生物宿主生物合成植物天然产物的快速发展趋势，并为解决植物天然产物来源不足提供了便捷的方法。
生物碱是一类结构复杂的含氮杂环化合物，也是中草药植物重要的药用成分，其中，四氢异喹啉类生物碱Noscapine作为新型抗癌药物，具有抗肿瘤活性高、毒副作用小，且作用机制独特且，它可在人类细胞中结合微管蛋白，将细胞周期阻断在有丝分裂中期。生物信息学分析显示，Noscapine由10个基因编码5种独特酶而合成的，这10个基因作为一个复合基因簇而存在。据此，Thilo Winzer等人[7]提出了Noscapine生物合成途径的新理论，这为在异源宿主中完整合成该物质奠定了基础。
目前已应用于大片段基因簇克隆的方法有基因组文库构建[8]、RecE蛋白介导的同源同组[9]，以及转化介导的重组克隆（Transfomation-associated recombination cloning, TAR克隆）[10]等。基因组文库随机捕获基因组序列，工作量大，筛选麻烦；RecE介导的同源同组克隆要求目的基因簇两端有合适的酶切位点，且克隆长度较短（无法克隆40 kb以上的DNA片段）；TAR克隆利用酵母的高效同源重组系统捕获大片段基因簇，Yamanaka等用TAR克隆技术直接从链霉菌Saccharomonospora sp. CNQ-490 基因组中克隆了67-kb的taromycin基因簇，然而该方法效率较低。
以上克隆策略由于克隆长度有限，难以满足长达上百kb的植物次生代谢基因簇的克隆，如Noscapine基因簇长达104 kb，因此需要开发新的克隆技术以克服DNA转化过程对大片段的内化限制。利用合成生物学原理，将FLP/FRT重组系统[11]与CRISPR/Cas9染色体编辑技术[12]结合，直接将Noscapine基因簇从植物基因组上克隆并转化入异源宿主，进行内含子删除、启动子/终止子替换，有望实现其原核表达。
FLP/FRT重组系统可使两个同向排列的FRT位点之间的DNA片段发生环化。FLP/FRT系统可使植物细胞中300 kb的DNA片段发生环化，为植物基因簇的定向捕捉提供了可靠的技术支持。FLP/FRT位点特异性重组系统因其具有较高的重组效率和靶向性，已在动物、植物以及微生物的遗传改性方面得到广泛应用，实现了基因敲除、基因敲入、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等基因工程操作[13]。重组酶FLP是酵母细胞内的一个由423个氨基酸组成的单体蛋白，Flp发挥作用不需要任何辅助因子，并且在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序列构成，8 bp间隔区序列是链的断裂、重接、Holliday交叉(holliday junction)中间体分枝的移动等重组过程的发生区域，其不对称性显示整个重组位点具有方向性，重组位点的不同定位形式(同向或反向)决定其重组方式，该系统发挥作用的最适温度为30℃[14]。
CRISPR/Cas9技术为FRT及相关基因元件在目的基因簇两端的精确打靶提供了高效的技术手段。CRISPR/Cas9是一种目前应用广泛且操作简单的染色体编辑技术。CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。该系统通过将入侵噬菌体和质粒 DNA 的片段整合到 CRISPR 中，并利用相应的guide RNA来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术主要是基于这种细菌免疫系统改造而成[15]。CRISPR/Cas9系统已广泛用于微生物染色体编辑，近来研究表明也逐渐用于植物、哺乳动物以及人类细胞中[16，17]。其作用机理如图1.
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