1、研究背景
人类对于核酸的研究已经有100多年的历史。20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术。但是，由于核酸的含量较少，一定程度上限制了DNA的体外操作。是Khorana(1971)等最早提出核酸体外扩增的设想：经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因。但由于当时基因序列分析方法尚未成熟，热稳定DNA聚合酶尚未报道以及引物合成的困难，这种想法似乎没有实际意义。美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，即聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR），又称为无细胞分子克隆法。在以后的几十年里，PCR方法被不断改进：它从一种定性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的半保留复制链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
但当扩增较长的基因片段时存在两个有损于DNA的因素：①高温常使模板DNA受损，使聚合酶不能延伸核苷酸。②pH太低不利于核苷酸在新链中键的形成。常用的方法是缩短变性时间，加用助溶剂，如甘油，使模板DNA在比一般情况低温时发生解链。富含GC的DNA片段易形成二级结构,也给PCR扩增带来困难。常采取的策略如下：(1)在PCR反应体系中加入DMSO或甘油，这样有助于富含GC的DNA的变性，可减少由于DNA二级结构对扩增酶延伸作用的影响。(2)采用不同浓度的PCREnhancer溶液，同时对每种PCREnhancer浓度设置一定的退火温度范围，再加上热启动，从中找寻求最佳的扩增条件。
参考文献：
[1]刘怀如，张桂萍.PCR技术的应用及前景展望[J].泉州师专学报，1999，17(6).
[2]陶生策，张治平，张先恩.PCR技术研究进展[J].生物工程进展，2001，21(4)：26~29.
[3]张新宇,高燕宁.PCR引物设计及软件使用技巧[J].生物信息学，2004，4(2)：15~18.
[4]肖生祥.PCR原理及应用中存在的问题[J].中国皮肤性病学杂志，1998，12(4)：242~243.
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