课题背景：19世纪下半叶，人们首次在对噬菌体的宿主特异性的限制与修饰现象的研究中发现了限制性内切酶的存在。之所以细菌可以抵御外源病毒的入侵，主要依靠的便是细胞内部的限制性内切酶可以摧毁外源DNA序列的能力，保证自身遗传物质的正常克隆与表达。首批被发现的限制性内切酶主要包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于Haemophilus influenzae的Hind II和Hind III。这些限制性内切酶可以在特定的位点即特异性的碱基序列位置切开DNA，产生带有特定末端的DNA片段。这种特殊的功能可以用于研究基因的组成、功能及表达，起着十分关键的作用。为分子生物学的研究提供了更加方便的工具。
当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候，以NEB为代表的许多公司开始寻找更多的限制性内切酶。除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原核生物中被发现。人们正在从数以千计的细菌及古细菌中寻找新的限制性内切酶。而对已测序的原核基因组数据分析表明，限制性内切酶在原核生物中普遍存在--所有自由生存的细菌和古细菌似乎都能编码限制性内切酶。
上世纪80年代，NEB开始克隆并表达限制性内切酶。克隆技术由于将限制性内切酶的表达与原有细胞环境分离开来，避免了原细胞中其它内切酶的污染，从而提高了酶的纯度。此外，克隆技术提高了限制性内切酶的产量，简化了纯化过程，使得生产成本显著降低；克隆的基因很容易进行测序分析，表达出的蛋白也能进行X射线结晶分析，技术的发展更加便于限制性内切酶的克隆表达与纯化。
课题目的：通过已知序列进行限制性内切酶基因的人工合成以及表达，探索全人工合成表达限制性内切酶的可能性以及效力。
限制性核酸内切酶是一种可以特异降解外源DNA的酶类，通过对外源基因的降解维护宿主细胞的稳定遗传。我们通过对限制性内切酶的基因序列的研究，设计引物。通过多引物PCR合成目的基因序列，并将其转入相应的表达载体中，表达出限制性内切酶。通过蛋白质提纯技术，得到限制性内切酶的产品，并对其活性进行验证。
限制性内切酶虽然可以降解外源DNA序列，但是却对自身的宿主细胞没有降解作用。原因在于，每一种特异的限制性内切酶都有自己相应的甲基化酶的基因。它们成对的存在于宿主细胞内部，对外源基因序列进行降解，保证自身遗传的稳定性。
根据限制性内切酶的切割特点，可以将其分为两类。一类酶切割DNA序列并没有特异性，而另一类只有识别特定的碱基序列才能进行切割工作。基因工程中通常使用具有特异性碱基序列位点识别切割的限制性内切酶作为工具酶进行基因的内切连接等工作。限制酶在特定切割部位进行切割时，按照切割的方式，又可以分为错位切和平切两种。错位切一般是在两条链的不同部位切割，中间相隔几个核苷酸，切下后的两端形成一种回文式的单链末端，这个末端能与具有互补碱基的目的基因的DNA片段连结，故称为黏性末端。这种酶在基因工程中应用最多。另一种是在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无黏性末端的平口。
限制性内切酶之所以不会切割自身的DNA序列与其相应的甲基化酶存在很密切的关系。例如，限制性内切酶NCOI可以识别基因序列上的5C^CATGG,其相应的甲基化酶命名为M.NCOI，可以将相应的识别位点进行甲基化保护。我们选用PUC19作为甲基化酶基因的载体，转入宿主菌T7中，测序保留正确质粒。用PET 30a 作为限制性内切酶的载体，转入宿主细胞TOP10中，测序保留正确质粒。将两段基因分别拼接到表达载体中，在IPTG诱导下表达限制性内切酶的产物。
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