《重组Reg3a及3b蛋白的表达与纯化》开题报告
摘要：Reg蛋白是在研究胰腺再生实验过程中发现的蛋白超家族，其主要作用是促进胰岛beta;细胞增殖和新生，从而有利于糖尿病的治疗和回复。利用基因重组的方法获得目的基因，扩增后导入载体并表达纯化，并获得目的蛋白进行研究。
关键词：Reg3 Reg蛋白家族 糖尿病 蛋白的表达 蛋白的纯化
胰岛素和胰岛血糖素是人体必须的两大激素，它们由胰岛内beta;细胞和alpha;细胞所分泌，是调节人体代谢和生理活动的重要化学物质。在病理条件下，胰岛细胞的胞损伤能够引起严重的糖尿病，其发病根源在于胰岛beta;细胞数量的大幅度减少，最终导致自身免疫的1型糖尿病的形成。此外，beta;细胞数量不足，也是胰岛素耐受的2型糖尿病发病的重要因素[1-5]。在2型糖尿病中，淀粉在胰腺内的沉积[6-9]以及高血糖[10]会导致beta;细胞凋亡从而完成beta;细胞数量减少的进程，进而降低胰岛素的分泌。目前增加beta;细胞数量的主要治疗方法是胰岛移植，但是由于术后免疫抑制较困难，以及胰岛捐赠数量的严重不足成为了胰岛移植的瓶颈问题。
Reg蛋白是在研究胰腺再生实验过程中发现的蛋白超家族[11]，其主要作用是促进细胞增殖和新生，保护细胞免于细胞凋亡。利用Reg蛋白的作用促beta;细胞增殖已然成为提高beta;细胞存活率的研究重点。近几年来的研究揭示了Reg3alpha;能够在体外刺激beta;细胞系的增殖[12]；而Reg3beta;能够在1型糖尿病小鼠模型中产生保护性作用，维持beta;细胞的数量和活性缓解糖尿病症状[13]。所以，重组Reg3alpha;和-3beta;蛋白的相关研究能够填补这些Reg家族成员在药物开发领域中的空白，也很有可能成为新发现的维持胰岛beta;细胞数量的又一个新的突破点。
Reg家族蛋白归属于钙样凝集素，均含有约由120个氨基酸组成的钙依赖性的碳水化合物识别结构域。其主要分布于血浆、胞外基质、质膜等处，功能可能是作为受体而激活一系列的生理反应，如细胞内吞、细胞贴附和体液免疫[14,15]等。由Reg蛋白构成这个独特的含有碳水化合物识别结构域的家族蛋白能够被分泌并且蛋白本身是可溶于血浆中，所以我们有理由相信Reg蛋白的功能并不仅仅局限于识别碳水化合物。
在小鼠基因序列同源比对中，发现这些Reg蛋白含有28个保守氨基酸残基，其中包括6个半胱氨酸，说明分子内二硫键的存在[16]，并且这些氨基酸残基构成了Reg蛋白家族内相似分子空间构象。在这些Reg蛋白中，不同成员之间也存在着差异。在人、小鼠和大鼠中，这些Reg家族基因在染色体上存在的位置相近，串联顺序和内含子外显子排列顺序相似，表明Reg家族蛋白来源于相同的祖基因[17]。在人体内，Reg3beta;能够在血浆中被检测出，其浓度在胰腺炎患者中显著上升。在离体培养的胰岛培养液中也能检测出Reg3beta;的存在，表明Reg蛋白在内分泌领域占据着相当重要的位置[18,19]。另外，在胰腺的导管细胞中也发现了Reg1和Reg2蛋白的表达，说明Reg蛋白也能通过外分泌腺分泌而进入消化道[20]。迄今，虽然还没有报道证实Reg蛋白功能的活性结构域，但初步研究指出仅仅15个氨基酸残基组成的INGAP-15多肽能够促进细胞的增殖和分化[21]。人类Reg家族蛋白共有5种，均含有37个氨基酸残基的保守序列，其中包括6个半胱氨酸。总体来说，通过序列同源比对，哺乳动物的Reg家族蛋白可以被分类为3个基因亚家族，即Reg1/Reg2，Reg3和Reg4。
研究发现，1型糖尿病人发病初期，Reg3beta;水平在胰腺胰岛中的表达显著提高[19]。所以，即使Reg家族蛋白的作用机理还没有被实验明确证实，但是我们可以推断，Reg家族蛋白的表达与胰岛发育、beta;细胞损伤以及糖尿病密切相关。
虽然所有的Reg家族蛋白都能在胰腺总提取物中被检测出，只有Reg2、Reg3alpha;和Reg3beta;存在于胰岛中。实际上，双标记发免疫荧光检测发现Reg2和Reg3alpha;分别分布于小鼠胰岛beta;细胞和alpha;细胞中。在人源胰岛中，可以在alpha;细胞以及Glucagon表达的肿瘤细胞中清晰的检测出Reg3beta;。而且Reg1、Reg2和Reg3beta;在胰岛beta;细胞的自身免疫中被认为作为自身抗原而引起T细胞攻击。在新发展的1型糖尿病病人中，Reg3beta;在胰岛的表达水平急剧上升，可能作为细胞表面的自身抗原引起T细胞免疫反应；在1型糖尿病病人中，在血液中检测出了抗Reg1的自身抗体。早期对小鼠接种完整Reg2蛋白或C端片段作为早期疫苗，可以减缓NOD小鼠的糖尿病发病。所以，Reg蛋白可能对于beta;细胞的作用具有两面性：既是一种beta;细胞营养因子，又是能够造成1型糖尿病的自身抗原。每一种Reg蛋白都有不同的三级结构性质以及组织特异性分布，因此对于整个Reg家族中的各个Reg蛋白研究是十分必要的。
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