胚状体研究现状综述
摘要：胚胎干细胞 (ESCs) 是一种多能细胞，能够分化成各种体细胞和生殖细胞。当在无抗分化因子的悬浮液中培养时， ES 会自发分化并形成三维多细胞聚集体，称为胚状体 (EBs) 。EBs 模拟了早期胚胎发育的特征，并在 ES 体外分化中发挥了重要作用。本文综述了近年来 EB 的研究进展，重点介绍了 EB 形成的技术、设备和方法：细菌级培养皿液体悬浮培养、甲基纤维素半固态培养基培养和悬滴培养。此外，还采用圆形底 96 孔板法，旋转瓶和生物反应器进行搅拌悬浮培养。每一种方法都有自己的特点，应该根据目标选择合适的 EB 形成方法。由于 EBs 的三维结构，其分化受到强烈胞外微环境的影响。此前 EB 分化方法主要集中在控制 EB 大小、可溶性因子添加上。这样的策略旨在从外部影响 EBs 的分化，期望通过分子工程直接在 EBs 内部设计微环境，以增强 ESCs 的定向分化，有效地指导细胞的命运。
关键词：胚胎干细胞； 胚状体； 胚状体形成；分化
胚胎干细胞 (ESCs)自从囊胚的内部细胞团中分离出来，[1]能够在体外无限的自我更新，并分化成包含三个原始胚层的细胞。[2]小鼠和人类 ES 都是在饲养层存在的情况下进行常规培养，以保持其干性。当维持 ES 干性的因素被去除后，胚胎干细胞会自发地分化成三个胚层的衍生物[3]。一般来说，多能干细胞聚集，再悬浮培养，形成的三维 (3D) 聚集体被认为是一个 EB 。它们不是由细胞聚集偶然形成的，而由具有潜在分化能力的干细胞的有意和程序化聚集而形成的。根据分化过程中的基因的表达分析，EBs 在三胚层中经历了类似原肠胚的发育过程，不同细胞谱系特异性的胚胎标记物区域性表达。体内环境复杂且研究能力有限，无法深入了解干细胞分化的关键。相比之下，体外分化的 ESCs 提供了更多受控的方法。因此，EB 的形成已被广泛应用于小鼠和人类 ES 的体外分化研究。
由于对 EB 及其微环境的生化和生物物理参数认识不足，EBs 的形成和分化尚未得到完全控制，在大多数报道中，所有 EBs 在不同阶段都被简单的描述为拟胚体。无论是用什么方法诱导的，EB 形成的描述过于简洁。考虑到胚状体的形成是 ES 体外分化研究的有力工具[4]，我们应该更多地关注 EB 形成的技术、设备和程序。
胚胎干细胞体外形成 EB 的一般方法
EB 形成的基本培养方法:第一是在不添加 LIF 、饲养层细胞等抗分化因子；然后是由单层培养向三维培养转变。虽然目前还没有普遍认同的 EB 形成基准，但 EB 的大小、形状和同质性等特征通常被用作比较的参考点。在这篇综述中，我们将详细介绍诱导 ES 细胞体外分化成 EB 的三种基本方法：即细菌级培养皿液体悬浮培养，甲基纤维素半固态培养基培养（MC 培养），悬滴培养（HD 培养）以及一些新的改进方法。
1.1 在细菌级培养皿中悬浮培养
采用无菌级培养皿进行 ES 细胞悬浮培养诱导 EB 形成。通常将 10ml 密度为 103-106 个细胞/ml 的 ES 细胞悬液放入 100mm 细菌级培养皿中。移入的 ES 不会附着在培养皿的塑料表面上，它们会自然地相互粘附，在没有任何晃动的情况下形成聚集。例如，小鼠 ES 细胞在细菌级培养皿中形成的 EBs 可诱导产生神经祖细胞、血管细胞[5]等。
但是在细菌级的培养皿中，由于 ES 都是自发聚集，每个聚集体中所包含的细胞数量是不同的。因此，形成的 EBs 的数量和大小取决于 ES 细胞偶然相遇的概率，产生的 EBs 的大小和形状往往是异质的[6]。此外，还经常会出现大细胞团块或 EBs 之间的聚集。对于这种方法，控制过度的细胞聚集是至关重要的。目前已经做了一些尝试，例如，将预制好的 EBs 转移到搅拌悬浮培养液中，或将 ES 细胞封装在指定大小的琼脂糖水凝胶胶囊中[7]。通过这些策略，细胞和 EBs 之间的相互作用得到控制。然而，这些方法不适用于 EBs 的大规模生产。
1.2甲基半纤维素培养
MC 培养是在半固体悬浮液介质中获得物理分离的 EBs 。当胚胎干细胞被播种到半固态的甲基纤维素培养基上时，由于基质的隔离，它们倾向于保持单一，可获得克隆来源的 EBs ，从而提高了 EB 分化的整体同质性和再现性。之前Wiles 和 Keller [8]等人员的报道中称，由于因子可以局部积累在 EBs 周围的甲基纤维素基质中，造血细胞可以有效地生成。因此MC 培养常被用于研究 ES 细胞的造血分化。但最近一份比较造血分化效率的报告显示，诱导 EB 形成的三种基本方法之间没有差异。[9]
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