Six3Cre转基因小鼠的基因型鉴定
摘要：随着分子生物学、细胞工程、遗传工程技术及繁育新技术等技术手段的发展，转基因小鼠应运而生，转基因小鼠是生物学家利用分子生物学、细胞工程、遗传工程技术及繁育等各项新技术，对实验小鼠基因组进行定向地改造或修饰，使改造后的小鼠有特定的生物表型或特性，从而便于生物学家利用其作为人类或其它重要动物的疾病模型，研究疾病的发病机理或筛选预防治疗用药物，或者作为载体研究基因的功能、调控机理及相互作用等基因的作用机制。由此可见，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型，小鼠是最早建立的转基因动物模型，利用转基因小鼠进行生物学或生物医学研究是当前生命科学发展的主要内容之一。转基因小鼠的每一个细胞通常都带有转基因或者通过基因修饰（基因剔除）。尽管如此，建立一种系统，能选择性控制某个基因在体内某些组织或细胞中特异性表达，将会很有用处。为此，遗传元件中发展了Cre-loxP重组系统。而进行Six3Cre转基因小鼠的基因型鉴定则是为了Cre-loxP重组系统的材料做准备，为后续的实验更顺利进行。
关键词：转基因小鼠； Cre-loxP重组系统； PCR；基因型鉴定
一、文献综述
目前Cre-LoxP重组酶系统在转基因小鼠的构建中已广泛应用，所研究课题通过基因敲入构建出Six3Cre转基因小鼠，扩大繁殖后利用PCR技术鉴定筛选出成功构建的Six3Cre转基因小鼠，为后续的Cre-LoxP重组实验提供材料支持。
1980年，美国科学家Gordon及其同事等利用显微注射将纯化的外源基因注于小鼠受精卵前核，实现了外源基因在小鼠的表达，首次获得转基因小鼠。目前转基因小鼠已广泛用于生物研究领域，其中主要包括疾病模型研究、基因表达、新药毒理实验以及医药开发应用等。Cre-loxP技术已广泛应用于研究组织特异性基因失活所产生的生物学效应，以期建立人类疾病研究的模型。Cre-loxP系统构建的条件性基因敲除小鼠现已广泛应用于免疫学、人类动物疾病模型复制及人类疾病发病机制、基因功能鉴定和表型研究等领域。现今基于Cre-loxP系统的条件性基因敲除小鼠因其良好的实验效果得到了许多研究者的青睐，现已有多篇相关文献的成功报道。但Cre-loxP系统作为一项新技术，其相关原理及应用归纳尚不完善，在不同实验中构建Cre-loxP系统条件性基因敲除小鼠的具体方法也有所差异。
在杨东升等学者的论文中说到在重组酶中, Cre重组酶不需要其他一些辅助因子就能够完成活体内和体外细胞中的 DNA重组 ,而且重组的效率远远高于其他重组酶。Cre/Loxp系统所具有的特性主要是因为 Loxp位点能够做到准确明显的标记靶基因, 在目前利用 Cre重组酶所得到的转基因动植物模型中还没有发现Loxp位点之外的特异性重组。当 Cre结构基因置于一种组织特异性的启动子的调控下,它可以完成在不同组织和器官的特异性的表达并且可以随着细胞分裂和传代进行遗传。而且, Cre重组酶介导的 DNA重组不受切除片段长度和位置的限制，只要靶基因被2个识别位点标记就可以准确地进行DNA重组。在Yuanwu Ma等人论文中也已经证明CRISPR / Cas9是产生某些等位基因和基因敲入大鼠的简单而有效的工具。由于Cre/Loxp系统有以上的优点, 可以将其应用到转基因动物、转基因植物等实验中, 必定会得到理想的结果。在Xu yong-xue等人的论述中Cre-loxP系统已被广泛用于研究基因功能和去除许多物种中的选择标记，包括人胚胎干细胞，小鼠，植物，原核和真核微生物。该系统也成功应用于工业微生物以解决基因功能和 构建高效的工程菌株。因此Cre-loxP重组系统的应用非常重要。
徐燕霞等人使用Cx43loxp/loxp和Lyz-Cre/ 转基因小鼠进行繁殖、交配，筛选出Cx43基因条件敲除小鼠（Cx43KO小鼠）作为动物模型，并对骨髓、髓外造血器官和外周血进行鉴定，进一步研究Cx43调控恶性血液病增殖、凋亡和药物敏感性等方面机理，为临床用药提供理论依据，结合丁海峰等人的基因敲除技术理论，为本实验提供技术支持。其研究也证实，骨髓细胞特异性表达Cre重组酶并不能使所有骨髓细胞的目的基因敲除，如成熟的巨噬细胞敲除率仅为83%-98%；而且敲除也不一定仅限于骨髓细胞，如研究发现可能在脾脏的一种树突状细胞发生约16%的敲除。所以敲除细胞的类型也需要探究。
在选用转基因动物鉴定方法时，通过参考张淑静等人的实践了解到，在目前转基因动物的鉴定的两种方法中，一种是分子杂交法，包括DNA印记法和斑点杂交法，但是两种方法都需要使用探针，成本比较高，而且斑点杂交法在转基因动物的内源性基因和外源性基因的同源性高时，检测结果的假阳性高；另一种是PCR法，只针对目的基因设计一种引物，此法简便，检测效率高，但假阳性较多，检测的准确性差;也有同时采用两种方法的，但是都不是很理想。所以为了保证鉴定的准确性，降低假阳性的出现，设计了双引物的 PCR，在 Loxp 位点以及目的基因的上下游分别设计了一对引物，这样降低了因内源性基因和外源性基因的同源性高而出现的假阳性结果，准确快捷。根据孔维健等人的论述要研究某一特定基因在机体内的具体作用及功能，往往需要抑制该基因表达或敲除该目的基因，直接敲除目的基因与利用外界化学或生物条件抑制基因表达相比，其效果更明确具体，更能直观的反应基因的作用。张淑静等人研究采用Cre-loxp重组酶系统，成功构建的转基因小鼠，可与各种诱导的启动子Cre转基因工具小鼠杂交，通过识别 Loxp 位点将抗性标记基因切除，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。在下一步将与不同组织特异性的 Cre 小鼠杂交，研究这两种基因在不同组织中因表达上调而产生的影响。为本实验提供了实践基础。
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