利用吗啉代寡核苷酸技术下调早期斑马鱼胚胎zmiz1a基因的功能研究
摘要：斑马鱼作为一种新兴的重要模式动物之一，体外受精、胚胎透明，在生命科学领域中应用前景十分广阔。斑马鱼体型小，适合高通量研究，还具有生长繁殖周期及其与人类高度相似的基因组等优点，已经广泛用于人类疾病模型的建立、新药研发和药物的筛选。此课题利用吗啉代寡核苷酸技术建立下调斑马鱼zmiz1a基因，在斑马鱼zmiz1a基因序列中选择靶点,设计针对斑马鱼zmiz1a基因的吗啉代寡核苷酸序列,并通过显微注射的方式注射到斑马鱼胚胎中。提取RNA进行体外转录，体外转录后得到的cDNA进行PCR鉴定，验证morphlino的有效性和黑色素含量的测定以及测定酪氨酸酶活性。
关键词：斑马鱼；吗啉代寡核苷酸技术；zmiz1a基因；显微注射技术；黑色素；酪氨酸酶活性
1 吗啉代寡核苷酸技术的发展与应用
寡核苷酸是生物医学和生命科学研究中调节基因表达的基本工具，并被开发为基因靶向治疗药物，用于治疗病毒、肿瘤和遗传病。寡核苷酸药物主要包括反义寡核苷酸、小干扰 RNA、核酶、脱氧核酶、反基因、 CpG寡核苷酸、转录因子诱饵和核酸适配体等[1]。
吗啉代寡核苷酸技术（Phosphorodiamidate Morpholino Oligomer）基本原理是把核苷酸上面的五碳糖环用一个吗啉环（morpholino）取代，同时对原有的磷酸基团也做了改变。使得这样一个DNA分子类似物可以以碱基配对配对的方式同RNA和DNA单链结合，但是由于结构的改变，使得整个分子不带有任何电荷，因此无法被任何酶所识别，包括DNase和RNase. 使得这类物质在细胞内有着极强的稳定性。在此基础上，如果你针对某一个基因的mRNA，设计一段反义的PMO寡聚物，在细胞内这个寡聚物和RNAi一样，通过与mRNA结合，来阻断这个mRNA的翻译，使得某个基因的在表达水平上被阻断，继而达到敲出基因的目的。但是这种技术与RNAi不同的地方是RNAi可以通过RNase H来实现目标mRNA的降解。而单独的PMO与mRNA结合并不能导致mRNA的降解。
吗啉反义寡核苷酸技术现已广泛应用于发育过程中基因功能的研究;鉴于吗啉反义寡核苷酸能与病毒特异mRNA结合,形成的双链物可有效阻断病毒RNA的转录,从而抑制病毒的复制,所以该技术已应用于医学研究,如治疗病毒感染、癌症、肌营养不良症和早老综合症等疾病。吗啉反义寡核苷酸技术主要通过阻断 mRNA 剪接过程来达到抑制目标基因功能的作用，已经被广泛用于发育生物学和医学研究中，并取得了十分理想的效果，它作为新一代的反义核酸技术已显示出其重要的科学意义和良好的应用前景。随着分子生物学技术的飞速发展，吗啉反义寡核苷酸技术将日臻完善，从而提高反义分子被细胞摄取的速率及程度，提高靶向性，稳定性，降低毒性。将此技术应用于更广泛的领域将有助于人类发现控制某些性状的关键基因，筛选最优的反义靶序列，从而提高反义治疗效果[2]。
2 实验的作用机制
吗啉代寡核苷酸技术的原理基于 RNA 的五元核糖骨架被含有氮和氧的六元环替代，并相连于 A、T、C、G 等碱基。RNA-MO 进入细胞后，可以和目的基因 mRNA 结合，形成 RNA-RNA 双链，抑制细胞内正常 mRNA 的剪接过程，从而达到抑制基因表达的目的。本实验设计的吗啉代寡核苷酸序列与目的基因 mRNA 5rsquo;翻译起始序列附近大小为 25 个碱基序列互补，在目的基因mRNA 5rsquo;端形成稳定的 RNA-RNA 双链，通过阻碍mRNA 和核糖体的结合而阻断zmiz1a 基因的起始翻译过程[3]。
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