Crisper/Cas9系统介导的斑马鱼Park2基因的定点敲除
摘要：帕金森病（Parkinsonrsquo;s Disease）是一种常见的神经退行性的疾病，伴随有黑质致密部的多巴胺的神经元的缺失，在行为学表现为患者动作缓慢，身体失去柔软性，变僵硬等症状，目前针对帕金森并没有有效的根治手段，主要的治疗药物为左旋多巴以及司来吉兰,因此建立相应的疾病动物模型从而深入研究其发病机理具有重要研究价值。
斑马鱼（Daniorerio,俗称zebrafish）具有繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明、性成熟周期短、个体小易养殖等诸多特点，特别是可以进行大规模的正向基因饱和突变与筛选。这些特点使其成为功能基因组时代生命科学研究中重要的模式脊椎动物之一。在国际上，斑马鱼模式生物的使用正逐渐拓展和深入到生命体的多种系统（例如，神经系统、免疫系统、心血管系统、生殖系统等）的发育、功能和疾病（例如，神经退行性疾病、遗传性心血管疾病、糖尿病等）的研究中，并已应用于小分子化合物的大规模新药筛选。
CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA双链断裂（DSB, double strand break）。这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：一是低保真性的非同源末端连接途径（NHEJ，Non-homologous end joining），此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入（Indel），从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。利用靶向核酸酶可以在受精卵水平高效的实现移码突变，从而制备基因敲除模式动物。CRISPR/Cas9技术的出现，使得无需再使用相应物种的ES细胞系就可以制备基因敲除模式生物，且已成功应用于小鼠、斑马鱼、灵长类、果蝇等等。 第二种DNA断裂修复途径为同源介导的修复（HR, homology-directedrepair），这种基于同源重组的修复机制保真性高，但是发生概率低。在提供外源修复模板的情况下，靶向核酸酶对DNA的切割可以将同源重组发生的概率提高约1000倍。利用这种机制可以实现基因组的精确编辑，如：条件性基因敲除、基因敲进、基因替换、点突变等等.
关键词：帕金森病（Parkinsonrsquo;s Disease）斑马鱼 CRISPR/Cas9
- 文献综述
在国际上，斑马鱼模式生物的使用已经逐渐发展并深入到生命体的多种系统（例如:神经系统、免疫系统、心血管系统、生殖系统等）的发育、功能和疾病机理病因（例如，神经退行性疾病、遗传性心血管疾病、糖尿病等）的研究中，一些小分子化合物的大规模新药筛选也逐渐以斑马鱼作为模型[12]。目前CRISPR/Cas9技术主要于斑马鱼模型中用于基因鉴定和多功能研究，蛋白质等大分子有机物功能的探究，以及利用斑马鱼建立疾病模型进行药物筛选等方面的研究分析。结合斑马鱼胚胎和幼鱼发育快速的特点，CRISPR/Cas9对读码框序列的高效编辑使得可以在相对较短的时间内建立并筛选出稳定可遗传的突变斑马鱼，从而能够快速有效地推进生命科学相关研究。
Parkin 基因座最早是在 5 个患有常染色体隐性遗传的青少年帕金森综合征( 即 AＲ-JP) 的日本人中发现的，后来在世界其他家系中也有所发现。根据对Parkin 基因功能研究表明，作为泛素连接酶 E3 的Parkin 基因参与了泛素-蛋白水解酶系统，能够连接相关蛋白质使之通过泛素-蛋白酶体系降解，使细胞内蛋白质数量维持稳定，保证细胞正常的生命活动的进行; 但 Parkin 基因的变异而导致泛素-蛋白水解酶系统的功能障碍，使机体不能有效地清除因环境因素而产生的异常蛋白，选择性地在黑质多巴胺能神经元内积聚，阻碍了多巴胺递质释放和运输，产生 PD 症状，同时也产生细胞毒性，导致细胞死亡。因此,泛素-蛋白水解酶系统功能障碍是 PD 的一个发病因素.
PD症状会因为基因，年龄因素以及环境因素受到影响。
目前，PD 依旧是不可治愈的进展性疾病，在各种治疗方法中最为有效的方法仍是药物治疗。药物治疗遵循的基本原则为: 根据患者的年龄、主要症状类型、病情的轻重、经济承受能力及对药物的反应等要素制定个性化治疗方案，从单药小剂量开始，缓慢递增。尽量在功效上，“细水长流，不求全效”，争取做到以最小的剂量获得最佳疗效［11］。药物治疗应个体化，不应盲目加用其他药物，也不宜突然停药。治疗措施有多巴胺替代治疗，多巴胺受体激动剂，B-型单胺氧化酶抑制剂，儿茶酚-氧位-甲基转移酶抑制剂，金刚烷胺，手术治疗等措施对帕金森病进行治疗与控制。
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