CNGC10在植物抵御盐胁迫过程中的基因表达分析
摘要：环核苷酸门控离子通道(Cyclic nucleotide-gated Channels, CNGCs)是一类非选择性阳离子通道, 由环核苷酸的绑定直接门控。植物CNGCs可以通透Na ,K ，Ca2 等阳离子，并且对于调控逆境胁迫中胞内钙信号具有重要作用。本文综述了植物CNGCs的分子特性、结构、调节方式及功能方面的研究进展,并对今后有关该通道的主要研究方向做了展望。
关键词：环核苷酸门控离子通道（CNGC）；盐胁迫；钙信号；信号转导；
一、文献综述
随着环境危机的严重化，植物在逆境中的生长情况受到更多关注，众所周知植物在逆境中生长会对植物造成影响，伴随着世界人口的增加继而引发了粮食危机，为了满足世界范围内人口对于粮食的需求，一定要提高粮食产量，这与当前的越发严重的逆境相矛盾。土壤盐渍化（soilsalinization）是指土壤底层或地下水的盐分随毛管水上升到地表，水分蒸发后，使盐分积累在表层土壤中的过程。是指易溶性盐分在土壤表层积累的现象或过程，也称盐碱化。当今世界有许多植物因高盐环境其生长状况受影响，造成危害，即盐胁迫。盐胁迫是一种非生物胁迫，主要从两个方面胁迫植物：ensp;一是植物根部水分吸收问题，土壤的盐分浓度偏高会抑制植物根部对水分的吸收;ensp;另一方面是导致植物细胞离子中毒如果植物内部盐分浓度过高。在盐胁迫条件下，细胞内的各种生理活动会因为钠离子浓度过高而造成离子毒害。植物细胞应对盐胁迫的重要机制之一就是保持胞内离子稳态平衡，即将细胞基质中的钠离子排出，从而保证细胞的正常生理活动以及维持细胞内稳定的钾离子及钙离子浓度。作为植物第二信使的钙离子，在植物应对盐胁迫信号传递中起到非常重要的作用。在盐胁迫条件下，胞内钙离子浓度发生变化产生钙信号，植物会触发一系列防御机制，从而指导下游基因的表达，抵抗胁迫的侵扰。研究表明，细胞膜或细胞器膜上的钙通道是控制胞内钙信号的关键。
环核苷酸门控离子通道（Cyclic Nucleotide-Gated Channels, CNGCs）是一种位于动植物细胞中的非选择性阳离子通道。在植物拟南芥细胞中CNGCs家族有20个成员，有不同的生理功能。CNGCs在植物中主要参与了植物的病原体防御应答、生长发育、离子运输、花粉管延伸、逆境胁迫、耐热性以及向重力性等重要生理功能。1998年在筛选大麦钙调素结合转运蛋白时植物CNGC离子通道被首次确认的。CNGC在结构上具有6个跨膜结构域，从氨基端到羧基端是S1-S6,S5和S6形成孔状结构，环核苷酸结合区域在羧基端，现已经确定单子叶和双子叶植物中都存在CNGC。在拟南芥基因组中编码CNGC的基因序列有20个，而水稻基因组中类似假定序列有16个，另外，在菜豆、烟草等植物中也发现许多CNGC同源序列。说明植物CNGC离子通道基因可能是一个相对较大的基因家族。CNBD由三个alpha;螺旋（分别是alpha;A、alpha;B、alpha;C）和两个beta;折叠（beta;1和beta;2）构成，beta;1和beta;2组成的片层位于alpha;A和alpha;B之间。钙离子与CaMBD结合可以反馈调节CNGC通道的活性，当钙离子浓度高时，CaM与钙离子结合，CNGC通道关闭。在拟南芥中，CNGC家族成员之间序列同源性主要在55%-83%之间。
连接环核苷酸（cGMP和cAMP）与钙离子信号转导之间的纽带现认为是CNGCs，钙离子环核苷酸钙调蛋白和钙离子环核苷酸先进行整合，然后它们以一种整合的形式与CNGCs互相发生作用并以此控制离子通道的开关。腺苷酸环化酶可以被外界的刺激以及外界刺激产生的NO激活，进而引起细胞内的环核苷酸含量升高。在CNGCs的C端, 当CNGCs位于C末端的CNBD与环核苷酸结合后，使通道发生变构调节而打开, 进而活化CNGCs(Lemtiri-Chlieh和Berkowitz 2004) ，使细胞外的钙离子内流，细胞质内的钙离子浓度逐渐升高，从而激活钙依赖蛋白激酶（CDPKs），使下游靶蛋白磷酸化；细胞质内钙离子增加还会激活CaM,CNGCs与CaM结合后会阻止CNGCs与环核苷酸的结合使通道不具活性(Ma和Berkowitz 2011)，以此调控钙信号。然而, Fischer等(2013)研究发现, CaM绑定结合域位于异亮氨酸谷氨酰胺(IQ)基序处。CaM结合模式有两种，说明植物CNGCs的配体调节会比预期的更复杂。
有关CNGC家族成员的研究一直是个热点，近年也有很多研究。2005年Li等发现AtCNGC10可与酵母(CY162)和大肠杆菌(LB650)的K 吸收缺陷菌株的表型互补, 说明AtCNGC10参与K 的转运；2006年Gobert等利用AtCNGC3无效突变体的研究发现在100~140 mmol·L-1 NaCl条件下CNGC3的发芽率更低, 而在NH₄Cl和KCl条件下并未发现此现象; 当用相同渗透势的山梨醇处理拟南芥时, 突变体和野生型的萌发状况没有显著性差异。由此可见, 与野生型拟南芥相比, CNGC3突变体在萌发阶段对Na 毒害比较敏感。进一步研究，用Na 外排ena1-4缺失的盐敏感型酵母菌株G19进行试验并分析, 发现转入AtCNGC3基因的酵母菌株细胞与空载体细胞相比，前者积累了更多的Na 且对高盐环境更敏感, 说明在酵母细胞中AtCNGC3构成一个Na 功能渗透性通道。与Na 和K 的吸收实验相结合, 认为在成熟植物中离子在木质部的分配可能与AtCNGC3有关, 如果将AtCNGC3敲除, 离子就会大量积累, 影响植物体内水势, 从而对植物造成伤害; AtCNGC3在幼苗中可能参与了Na 吸收途径, 如果将其敲除, 会导致幼苗对高Na 的敏感性降低因为这些离子在植物体内积累的量太少。2007年Borsics等构建了正义的pBIN20-35S-AtCNGC10表达载体, 并将此表达载体转入到拟南芥akt-1突变体中, 发现转入载体的基因能部分互补突变体的K 吸收功能; 而反义AtCNGC10基因表达载体转入拟南芥后，K 水平降低40%, 说明AtCNGC10对K 有一定的选择性,保持植物细胞内的K 稳态。2008年Guo等研究发现拟南芥经盐胁迫处理后, 发现具有反义AtCNGC10基因的拟南芥株系细胞中K 外流减少, Na 外流增加, 从而提出AtCNGC10可能是K 外流Na 内流和Na 内流的通道。2010年，Guo等测定沿幼苗根部不同区域的离子通量（非损伤微测技术）,发现野生型(WT)与 AtCNGC10反义株系(A2和A3)的子通量有着显著不同的结果。且野生型的分生组织和伸长区的远端H 、Ca2 和Mg2 的内流显著高于反义株系A2和A3。另一方面, 野生型幼苗根部分生组织区域的细胞内pH值均显著高于在A2和A3, 这表明可能是通过细胞内低pH值反馈抑制H 内流进入分生组织细胞。在控制条件下, A2和A3株系成熟植物的地上部含低的Mg2 和Ca2 、较高的K 含量, 说明可能是因为韧皮部装载和木质部回流的变化, 使阳离子的长距离运输受影响(Guo等2010)。2015年Jin等同样对AtCNGC10响应盐胁迫的作用做了研究, 构建T-DNA并将其插入拟南芥得到CNGC10突变体,突变体在种子萌发和幼苗生长阶段的耐盐性比野生型更高。与野生型相比，CNGC10突变体地上部积累了较少的K 和Na ,但Ca2 含量变化不太; CNGC10超表达之后, 发现拟南芥植株对盐分更敏感; 而在互补之后盐敏感性恢复。此外还发现,在200 mmol·L-1 NaCl处理植株时，CNGC10在根中的表达受到抑制,并在处理6小时后CNGC10几乎不表达。因此提出CNGC10负调控拟南芥的耐盐性, 并介导Na 的转运。
Ca2 是植物细胞中重要的第二信使, 在信号级联放大中发挥重要作用。维持细胞内的Ca2 平衡对植物至关重要。CNGC10参与调控了植物应对盐胁迫的过程，而钙信号是植物重要的第二信使，在信号传递中非常重要，CNGC10在植物应对盐胁迫早期钙信号响应方面扮演什么角色并不清楚，因此本研究在此基础上进行研究，希望能够进一步阐明其分子机制，为接下来的耐盐农作物改造提供理论依据。本研究以钙信号作为切入点,以期进一步理解CNGC10 突变体在植物抵御盐胁迫中的相关基因表达情况，为进一步的分子机制研究做准备。
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