红豆杉种间差异
——紫杉醇生物技术研究进展
摘要：杉醇(Taxol),这个具有重大的抗癌药物,是全美癌症协会(NCI)在对植物进行筛分程序过程中使用瘤细胞列的方法发现的。存在于红豆杉科红豆属Tax-ax L.植物中的一种具有抗癌流性的二萜类化合物.本品属有丝分裂抑制剂,能诱导和促进微管蛋白聚合,从而阻止肿瘤细胞繁殖,对人体正常细胞无伤害,因而是一类全新的抗癌药物。不同的方法对紫杉醇进行了深入研究。
关键词：抗癌 液体培养 细胞培养 环境 注层析法 高效液相色谱 紫杉醇
一、文献综述
紫杉醇(Taxol),这个具有重大的抗癌药物,是全美癌症协会(NCI)在对植物进行筛分程序过程中使用瘤细胞列的方法发现的[1]。它是美国施贵宝公司开发的一种天然抗癌药物,其原料为太平洋紫杉的树皮.此药属于细胞抑止剂类药物,可干扰癌细胞的微管蛋白合成,发挥有效的抗癌作用,且对正常细胞基本无影响. 紫杉醇(paclitaxel)是存在于红豆杉科红豆属Tax-ax L.植物中的一种具有抗癌流性的二萜类化合物.本品属有丝分裂抑制剂,能诱导和促进微管蛋白聚合,从而阻止肿瘤细胞繁殖,对人体正常细胞无伤害,因而是一类全新的抗癌药物.据1999年1月8日出版的Journal of Mo-lecular Biology(lt;分子生物学杂志gt;)报道,美国佛罗里达州大学生物物理学家Makowshi领导的研究小组发现,紫杉醇的抗癌作用还可以作用于癌细胞上的Bcl-2蛋白,来促进癌细胞的程序性自杀(apotosis).关于紫杉醇的这种抗癌机理新发现,将有利于科学家研究更为先进的抗癌药物.
紫杉醇具有显著的抗癌活性和独特的作用机制，它的问世被誉为20世纪90年代国际上的抗癌药三大成就之一。历经40多年的研究与发展，在许多方面一度成为科学家研究的热点，并取得了许多可喜的成绩。本文综述了近年来对红豆杉的资源概括、抗癌机制、化学成分、制各方法、制剂新技术等方面的新研究进展，对当前工作中存在的问题进行了探讨，并对有关研究的发展前景进行了展望。研究了在固体和液体培养条件下云南红豆杉(Taxus yunnanensis)细胞系TY6生长和紫杉醇积累的动态及培养基中无机氮源形式对其生长的紫杉醇形成的影响.结果表明,在固体和液体培养条件下,云南红豆杉细胞的生长和紫杉醇积累动态相似,但液体培养时细胞生长周期缩短了7?d,紫杉醇含量降低了1倍;新形成的细胞需要经过一段时间生长后才有较高的紫杉醇合成能力;培养基中硝态氮浓度高有利于细胞生长,铵态氮浓度高有利于紫杉醇形成;在培养第12?d时用铵态氮培养基更换硝态氮培养基可使悬浮细胞的紫杉醇产量达到8.5?mg*L-1,比对照高1.6倍.通过考察紫杉醇提纯的多种方法,优化结晶析出法和柱层析法的工艺参数,首次将红豆杉细胞培养生产的65%的紫杉醇粗品分离纯化为符合美国药典USP标准的紫杉醇原料药.以红豆杉细胞培养生产的65%的紫杉醇粗品为原料提纯制备紫杉醇原料药的方法,重复性好、工艺合理、操作简单、绿色安全,有望解决紫杉醇原料药的药源供应严重不足的问题.研究光照强度对南方红豆杉中紫杉醇和10-脱乙酰基巴卡丁Ⅲ（10-deacetylbaccatin III,10-DABⅢ）含量变化,探讨其可能的环境适应机制。[方法]通过高效液相色谱法（high performance liquid chromatography,HPLC）测定不同遮光率（50%、70%和90%）分别遮光30、60、90d后紫杉醇和10-DABⅢ含量;通过PCR法测定相关酶基因表达量。[结果]光照强度能够影响紫杉醇的积累。遮光0～90d,空白组紫杉醇和10-DABIII含量呈下降趋势,各遮光组呈先升后降的趋势,但差异无统计学意义（P〉0.05）。其中50%和70%遮光组明显高于空白组及90%遮光组（P〈0.01）。此外,光照对紫杉二烯5alpha;-羟基化酶（taxane 5alpha;-hydroxylase,TH5alpha;）、紫杉烷7beta;-羟基化酶（taxane 7beta;-hydroxylase,7beta;）和紫杉烷14beta;-羟基化酶（taxane 14beta;-hydroxylase,14OH）基因表达也存在明显影响,70%遮光组TH5alpha;基因表达量随遮光时间延长而增加,14OH基因则下降（P〈0.01）。[结论]本研究初步得到光照因素可以影响南方红豆杉次生代谢产物的合成及相关酶基因的表达,适当的遮光（70%遮光）可以提高紫杉醇的含量,且遮光3月内紫杉醇含量稳定。
红豆杉（Taxus）是国家一级保护野生珍稀抗癌植物，其主要含有芳香烃类、二环紫杉烷类、木脂素类及黄酮类等化学成分，其中紫杉醇由于具有较好的抗癌活性而成为研究热点。红豆杉的树皮、枝叶、根部，甚至种子均可提取紫杉醇，多烯紫杉醇是在对紫杉醇结构改造过程中合成出来的紫杉醇衍生物，主要用于乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌等多种实体肿瘤的治疗，疗效显著，是继紫杉醇后又一种新型抗微管药物。分析曼地亚红豆杉Taxus media枝叶中紫杉醇含有量的动态变化。方法 HPLC法测定不同枝龄（1年生和2年生）、月份（1-12月）枝叶中紫杉醇含有量,分析其动态变化情况。结果紫杉醇含有量在4月1年生枝叶中最高（0.052%）,并随月份增加而逐渐下降,而在各月份2年生枝叶中较稳定（0.018%-0.023%）。到8月后,1、2年生枝叶中该成分含有量相当。结论考虑到枝条生物量及紫杉醇含有量,曼地亚红豆杉最佳采集时间和采摘部位为6月份1年生枝条。通过考察紫杉醇提纯的多种方法,优化结晶析出法和柱层析法的工艺参数,首次将红豆杉细胞培养生产的65%的紫杉醇粗品分离纯化为符合美国药典USP标准的紫杉醇原料药.以红豆杉细胞培养生产的65%的紫杉醇粗品为原料提纯制备紫杉醇原料药的方法,重复性好、工艺合理、操作简单、绿色安全,有望解决紫杉醇原料药的药源供应严重不足的问题.影响红豆杉中紫杉醇含量的因素较多。为了提高红豆杉紫杉醇及其衍生物的含量，国内外已开展大量研究，其中多数是以天然红豆杉为研究对象。研究表明，不同种类、树龄、器官、物候期、生长环境等因子对天然红豆杉中紫杉醇含量均有影响。本文综述了影响红豆杉紫杉醇含量的各种因子，并对紫杉醇测定方法、天然红豆杉与人工红豆杉中紫杉醇含量以及红豆杉中其它紫杉烷类化合物含量等进行了比较。
二、查阅中外文献资料目录
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