番茄DNA甲基转移酶CMT3基因敲除株系的构建
摘要：番茄是茄科茄属番茄亚属多年生草本植物，是具有基因组小和易培养等优点的模式植物。表观遗传是指DNA的序列不发生改变但是其基因表达可能会发生可以遗传的改变。因此表观遗传对农作物表型研究具有很大的影响。对于模式植物的表观遗传的研究也成为了近几年的重点研究问题之一。Crispr/cas9基因编辑技术的发现也对植物表观遗传的研究提供了帮助。
关键词：番茄；Crispr/cas9；SlCMT3基因；基因敲除；表观遗传
番茄是茄科茄属番茄亚属多年生草本植物。因其进化史长、基因组小、生长周期短、易培养等特点成为研究果实果肉发育与成熟的模式植物。近几年，在番茄果实发育与成熟调控方面的研究有了比较大的成果（Giovannoni，2004）。比如研究发现了大量与乙烯调控果实成熟的相关基因（蒋励和张小兰，2013）。从最近几年研究结果中发现，番茄果实的发育和成熟不仅会受到遗传模型的控制（Seymour等，2007），也会受到表观遗传的控制（Teyssier等，2010）。表观遗传是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质都可能发生了改变，而且这种变化是可以发生增值和遗传的。DNA胞嘧啶残基第5位碳原子的甲基化现象（5MeC）是当前动植物中研究最广泛的一种DNA共价表观遗传修饰（He等，2011)。番茄果实生长发育过程伴随着表观遗传修饰的动态变化，目前在调控番茄果实成熟的表观遗传机制上已取得重要进展，从各种研究成果中发现，DNA甲基化与番茄果实的发育和成熟息息相关（Zhong等，2013；Liu等，2005）。但是关于番茄果实发育和成熟过程中，对于番茄果实发育和成熟起调控作用的DNA甲基化水平与甲基化模式上的分子机制的研究仍然处于起步和探索阶段。在植物中，DNA甲基化主要发生在CG、CNG和CNN序列的C上（N=A，C，T），受到DNA甲基转移酶1（DNAmethytransferases 1，MET1）、植物特异性的DNA甲基转移酶CHROMOMETHYLASES（CMTs）和DomainRearranged Methyltransferases（DRMs）等三种类型的DNA甲基转移酶的调控（Bender，2004）。但是这些DNA甲基转移酶在番茄果实发育中的表观遗传调控作用机制还不清楚（Teyssier等，2010）。利用VIGS技术（virus-inducedgene silence, VIGS），Chen等（2015）指出DNA甲基转移酶基因对番茄自发突变体Cnr果实成熟有很大的影响，研究结果发现DNA甲基转移酶SlMET1，SlDRM7，SlCMT2，SlCMT3基因表达的抑制都可不同程度地回复果实成熟的表型，特别是SlCMT3沉默可以使突变体果实完全成熟（Chen等，2015）。因此关于SlCMT3的沉默对于番茄果实的发育与成熟有很大的研究意义。对于SlCMT3基因沉默的研究可以广泛运用到各种农作物上，不仅对农业的发展有很大的帮助，其研究成果也可以在理论上有助于揭示早期番茄果实发育的表观遗传调控机制，而且有助于促进番茄种质资源的鉴定及深度开发，为通过分子遗传育种途径培育优质、早熟（或晚熟）、耐贮或专用番茄品种提供理论基础，从而达到提高番茄产量和品质的目的。综上所述，SlCMT3在番茄果实发育和成熟中的表观遗传调控机制值得深入研究。
Crispr/Cas9是1987年被发现的，是种细菌和古细菌用于对抗入侵病毒和外源RNA的天然免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性识别，利用Cas蛋白进行切割，以达到对自己的免疫。不仅发现细菌可能利用Crispr系统抵抗噬菌体入侵；也发现了细菌Crispr系统可以阻止外源质粒的转移，第一次利用实验证明了Crispr系统的功能。在2002年Crispr被命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列。Crispr/Cas9系统作为重要的一种基因编辑工具，因为可以在特定的位点产生核苷酸的删除、插入或替换，从而改变编码基因的功能，所以从产生以来在可以在各种生物体基因组序列的精确编辑得到广泛应用（李江等，2018）。因为Crispr/Cas9基因编辑技术有操作简单、设计简便、基因修饰率高、可遗传廉价、便捷、通用性强、靶向精确性高、实验成本低等优点，所以该基因编辑技术被广泛应用于实验室研究中。因此，该项基因编辑技术也成为了继锌指核酸酶和转录激活因子样效应因子核酸酶后的第三代基因编辑技术（王洁等，2016）。对比锌指核酸酶和转录激活因子样效应因子核酸酶技术，Crispr/Cas9系统只需要设计一段与靶位点配对的含几十对碱基的核苷酸序列（刘婷婷等，2015），操作简单便捷。Crispr/Cas9系统是由sgRNA（single-guide RNA）和Cas9蛋白组成的RNA引导的DNA内切酶系统。单导向RNA（sgRNA）中会包含一段20bp左右的靶位点序列，它的靶位点在前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）的上方，为了将Cas9-sgRNA复合体在靶位点附近进行切割，可以通过PAM和靶位点的引导，会导致最后导致某些基因功能发生丧失，可能是因为在DNA双链断裂修复的过程中会在断裂位置引起若干碱基的插入、缺失或替换等突变，对DNA靶位点所在基因进行编辑所造成的。
Crispr/Cas9基因编辑技术也已经广泛应用到农作物品种改良、基因治疗、基因功能的研究等领域的研究中。在农作物品种改良的领域中，Crispr/Cas9基因编辑技术也已经应用于多种植物中，比如在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana benthamiana)、水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、番茄(Lycopersicon esculentumMill)等农作物中得到了广泛的应用（白英俊等，2018）。Crispr/Cas9基因编辑技术虽然在模式植物中得到了广泛的应用，但是在非模式植物中仍然还存在着许多问题需要进一步得到完善，特别是应用于一些小作物中还有许多问题尚未得到解决（白英俊等，2018）。利用Crispr/Cas9系统敲除基因，是不能同时编辑多个等位基因。但是Crispr/Cas9介导的基因敲除技术能够稳定的在番茄中实现基因敲除（成研等，2018）。故从现阶段各项研究成果中得出结论，虽然多靶点敲除基因技术还未得到广泛的应用，但是Crispr/Cas9可以基因实现多靶点的编辑（晁瑾等，2018）。
基因敲除是用一段已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。而基因沉默是指生物体中特定的基因由于种种原因不能表达或表达量很低的遗传现象。虽然两者都是使目的基因不表达，但是两者还是存在着很大的差异。其中基因敲除不能达到基因功能全部消失的原因是因为改变了DNA序列。而基因沉默则是不改变DNA的序列从而达到基因的低表达甚至是不表达。基因敲除优点在于操作简单，周期短，易于控制。综上所述，因此，本研究拟利用Crispr/cas9系统构建番茄SlCMT3基因敲除株系，为深入探究SlCMT3依赖的表观遗传修饰在番茄果实成熟中的分子机制奠定基础。通过研究其表观遗传不仅对于番茄果实的发育与成熟具有重大的意义，可以从表观遗传上观察到番茄果实的成熟时机，也可以广泛应用于农业生产上，对农业生产方面具有重大意义。
参考文献
[1] 白英俊, 李国瑞, 黄凤兰等. CRISPR/Cas9技术在非模式植物中的应用进展[J]. 中国农业科学, 2018, 10(11): 4-20.
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