开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 拟解决的问题
水蛭素是目前最强的凝血酶抑制剂，具有抗凝、抗血栓等药理作用。肽链由65 或66个氨基酸残基组成，相对分子量为7000 道尔顿，rHV3是其中一种突变体。分子N 端有三个二硫桥键( - S- S- ) ，分别在6 位、14 位、16 位、28 位和22 位、39 位的半胱氨酸残基, 使N 端肽链绕迭成密集形核心环肽结构。C 端富含酸性氨基酸残基， 63 位的酪氨酸被硫酸化。
本课题是对重组水蛭素Ⅲ（rHV3）发酵表达条件和分离纯化条件的优化研究。首先通过补料分批发酵的方法，利用OD值和溶氧变化确定补料的时间和速度，使得rHV3的表达量大幅提高。然后通过离子交换色谱、反向HPLC等多种纯化方法，使rHV3的蛋白回收率和纯度进一步得到提高，更能满足工业化生产的需要。
- 研究手段
1.按照说明配制试剂：LB液体培养基、LB固体培养基、发酵培养基、发酵补料培养基、2%NaOH、2%HCl、50mM柠檬酸-NaOH (pH3.0) 缓冲液、50mM Tris-HCl (pH 8.5) 缓冲液、50m柠檬酸-10%异丙醇缓冲液、50mM柠檬酸-30%异丙醇缓冲液、50mM Tris-HCl (PH7.4)缓冲液、 0.5%人纤维蛋白原溶液、凝血酶溶液（100NIH/ml）、20mM HAc-NaOH (pH4.2)缓冲液、20mM HAc-NaOH (pH5.0)
2.rHV3菌种活化筛选
3.补料批次发酵表达rHV3
4.rHV3的分离纯化
5.rHV3纯度的分析
- 文献综述
- 研究背景
水蛭素是迄今为止最强的凝血酶抑制剂。水蛭素是由65-66个氨基酸组成的分子量约为7000 Da的多肽，分子内含有三对二硫键。天然水蛭素都是从水蛭的头部提取的，产量有限，自从利用基因工程技术生产水蛭素以后，其研究开发得到了快速的发展。
研究表明: 水蛭素对凝血酶的作用是分两步进行的。最初的作用是凝血酶带正电荷的非催化位点，与水蛭素带相反电荷的极性C端产生静电作用，形成初始结合体，是反应的决速步骤，其形成取决于离子强度。第二步，该结合体通过控制扩散，迅速重排形成同凝血酶活性位点紧密结合的复合物。在该复合物中，C 端结合在凝血酶的纤维蛋白原识别位点，抑制凝血酶对纤维蛋白原的激活作用。被二硫桥键稳定的N 端密集链段，则同凝血酶催化位点结合，抑制凝血酶的催化作用。靠近凝血酶催化位点附近的精氨酸侧链袋( Arg Side ChainPocket)带负电荷的碱基，同水蛭素47 位赖氨酸残基作用。由于Lys47 被两侧的脯氨酸所包围，这一特殊三肽段Pro-Lys-Pro 不被一般蛋白酶所降解，也很难在反应中断裂，其稳定性具有重要的生物学意义。
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