课题背景：
天然存在的氨基酸主要为L-氨基酸，而D-氨基酸则被称之“非天然氨基酸”。人们曾经认为D-氨基酸在生物进程中发挥着相对较少的作用。随着氨基酸衍生剂、手性色谱柱和分析方法的发展，人们相继在微生物、植物和动物中发现了多种D- 氨基酸。目前，D- 氨基酸已成为制备半合成抗生素、药物、杀虫剂、生物活性多肽和食品添加剂等的关键中间体，其开发利用成为氨基酸产业的一个新热点[1]。尤其是现在受到广泛关注的抗生素耐药问题。青霉素等beta;-内酰胺类抗生素的长期广泛使用，使致病菌的耐药性不断增强，以D-型氨基酸为原料的半合成抗菌素是缓解耐药性的主要方法[2]。研究表明，D-氨基酸在细胞结构及信号调控中发挥着重要的作用，科学家们认为阐明D-氨基酸如何调控细胞壁重塑及生物被膜降解的机制不仅能够对细胞质外的进程有一个新的理解，并且能够促进新疗法的发展[3]。
D-氨基酰化酶(N-酰基-D-氨基酸酰胺水解酶)是一类能专一性水解N-酰基-D- 氨基酸，得到高纯度D-氨基酸的水解酶根据底物特异性可将D-氨基酰化酶分为三类：催化中性氨基酸N- 酰基衍生物水解的D- 氨基酸酰化酶(D-ANase)、专一性水解N- 酰基-D- 谷氨酸的N- 酰基- 谷氨酸- 酰胺水解酶(D-AGase)、专一性水解N- 酰基-D- 天冬氨酸的N- 酰基- 天冬氨酸- 酰胺水解酶(D-AAase)。目前所发现D- 氨基酰化酶多为第一种。不同来源D-氨基酰化酶的性质如下，分子量大多在50 kD 左右，最适温度在50℃左右，最适pH 偏弱碱性，最佳底物多为N-Ac-D-Met[4]，活性基本能被Zn2 、Hg2 和Cu2 抑制[5]。有差异的地方比如Pseudomonas sp. 1158 和B.borstelensis BCS-1 D-氨基酰化酶的分子量明显比来源于其它菌株的D-氨基酰化酶的分子量大许多；B. borstelensis BCS-1相比其它菌株更耐高温（最适T=70℃）和碱性环境（最适pH=9.5）。
获得D-氨基酰化酶的传统方法是利用菌株的诱导筛选获得酶表达的高产菌株[6]。而随着生物技术的不断发展，利用基因工程的方法来获得已知酶类成为一种高效、快捷的途径。本课题利用已获得的产D-氨基酰化酶的重组大肠杆菌来进行D-氨基酰化酶的融合表达和分离纯化。
试验流程：
1，D-aminoacylase的诱导表达
- 取已经构建好的重组菌在含有Amp（50mu;g/ml）的LB固体培养基上37℃培养至过夜。
- 挑选平板上重组菌1~2个单菌落，接入5mL含Amp（50mu;g/ml）LB培养液中37℃培养至过夜。
- 取1mL接入100ml含Amp（50mu;g/ml）LB培养液，250mL摇瓶中于37℃剧烈培养，至菌落密度OD600约为0.6（约2.5h）。
- 在培养物中加入IPTG（100mmol/L）至终浓度为1mmol/L，37℃继续通气培养3h。
- 取1ml放于Ep管中，室温高速（12000rpm）离心2min。
- 沉淀悬于100mu;L的1xSDS凝胶加样缓冲液，沸水浴加热5min，点动离心，冰上放置保存。
- 呆样品全部处理完以后进行菌体总蛋白的SDS-PAGE，检测目的蛋白表达量。
2，D-aminoacylase的活力测定
取lmL菌液离心后弃上清，用lmL底物（20 mmol/L N-Carbamyl-DL-Valine，20mmol/L PBS，pH8.0）重新悬浮，对照只用20 mmol/L PBS悬浮，37℃震荡反应30 min，13000 r/min离心l0 min，取1mL反应液加入400mu;l HAc-NaAc缓冲液（540gCH3COONa·3H2O,100ml HAc，400ml去离子水，pH 5.2）、600mu;L 2%茚三酮（100mg还原茚三酮，100mg水合茚三酮溶于10mL乙二醇独甲醚）和300mu;L 0.3%抗坏血酸溶液（10mg Vc，50ml去离子水），混匀后立即置于75℃水浴反应14 min，水浴结束迅速冷却，加入2.7mL 50%乙醇震荡后室温放置5 min后于OD570nm读数。酶活单位(U)定义为在上述条件下，以菌体浓度为1.0 OD600nm计，1min内生成1mu;mol D-缬氨酸所需酶量。
3，Western-blot检测
将诱导 3 h 的菌体、诱导前和诱导 3 h 的菌体及纯化的融合蛋白进行SDS-PAGE电泳后,转移至硝酸纤维素膜上，用5 %的脱脂奶粉封闭，再相继与小鼠抗兔His单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG进行孵育，用DAB 方法显色。具体操作步骤为：
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