利用CRISPR技术敲除本氏烟草FLS2基因
文献综述
1.CRISPR结构与功能
１.1CRISPR的结构
ＣＲＩＳＰＲ位点的结构ＣＲＩＳＰＲ位点由一个前导区（ｌｅａｄｅｒ）、多个重复序列（ｒｅｐｅａｔ）和多个间区（ｓｐａｃｅｒ）组成，这些重复序列与间区相互交替出现并串连成一个完整的 ＣＲＩＳＰＲ位点。前 导 区 一 般 是 处 于 ＣＲＩＳＰＲ 位 点 上游，由３００ｂｐ～５００ｂｐ碱基组成的一个 ＡＴ 富集的区域。这个区域一般来说在种内是比较保守的，但在种间却有显著的差异［1］。重复序列 一 般 由２３ｂｐ～５０ｂｐ的碱基组成，其平均长度在３１ｂｐ左右。这段序列在已给定的ＣＲＩＳＰＲ位点的多个重复中相对保守，一般只存在１个～３个碱基差异，这种差异被称为退化重复（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｒｅｐｅａｔｓ，ＤＲｓ），但在微生种间甚至于同一个基因组中的两个或多个不同的 ＣＲＩＳＰＲ位点间却存在很大的差异。通过对ＣＲＩＳＰＲＤａｔａＢａｓｅ［2］中贮存的所有重复序列进行分析，结果发现这些重复序列间没有明显的联系，但却具有二重对称性，这就意味着它能形成像发夹一样的二极结构。到目前为止，还没有关于这些重复序列具体功能的描述。间区由１７ｂｐ～８４ｂｐ碱基组成，平均长度在３６ｂｐ左右。在同一个ＣＲＩＳＰＲ位点中，基本上没有相同或比较相似的间区。通过长期的研究发现，部分间区序列与已知的或质粒、或噬菌体的序列相匹配［３］。在 ＣＲＩＳＰＲＤａｔａＢａｓｅ中的 间 区 序 列，只 有 约２％的 序 列 在 Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ中能找到相应的匹配，这可能是因为目前只有极少的噬菌体和质粒被测序分析，随着测序分析技术的逐渐成熟，这个比例在不断的增加［4］。
1.2CRISPR/Cas9 介导的打靶系统作用原理
细菌抵御噬菌体等外源 DNA 入侵时，在 Leader的调控下，CRISPR 被转录为长的 RNA 前体( PreCRISPR RNA，pre-crRNA) ，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟 crRNA，最终识别并结合到与其互补的外源 DNA 序列上发挥剪切作用［8，10-12］。根据参与的 Cas 蛋白质和序列的不同，将目前在细菌中发现的 CRISPR/Cas 系统分为 3种类型( I 型、II 型和 III 型) ［6，9，13］，其中 I 型和 III型 CRISPR/Cas 系统具有相似性: 特定的 Cas 蛋白质内切酶剪切加工转录出的 pre-crRNA，加工成熟后的 crRNA 与 Cas 蛋白质聚合成大的复合体识别并剪切与 crRNA 互补的外源核酸序列［7，12，14-19］; II型与上述两种系统存在着截然不同的区别，而且 II型 CRISPR/Cas 系统在目前研究中最深入［20］。在 II型系统中 pre-crRNA 的加工由 Cas 家族中的 Cas9单独参与［7］。Cas9 含有在氨基末端的 RuvC 和蛋白质 中 部 的 HNH 2 个独特的活性位点［5］，在crRNA 成熟和双链 DNA 剪切中发挥作用［20-21］。此外，pre-crRNA 转录的同时，与其重复序列互补的反式激活 crRNA( Trans-activating crRNA，tracrRNA) 也转录出来，并且激发 Cas9 和双链 RNA 特异性 RNaseIII 核酸酶对 pre-crRNA 进行加工［7］。加工成熟后，crRNA、tracrRNA 和 Cas9 组成复合体，识别并结合于 crRNA 互补的序列，然后解开 DNA 双链，形成 Rloop，使crRNA 与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由 Cas9 中的 HNH 活性位点剪切crRNA 的互补 DNA 链，RuvC 活性位点剪切非互补链［22］，最终引入 DNA DSB。研究结果表明，Cas9 还可以剪切线性和超螺旋的质粒，其剪切效率堪比限制性内切酶［22］。由于 crRNA 参与并且起到精确导向的作用，所以 CRISPR/Cas9 打靶系统也被称为RNA 导向( RNA-guided) 打靶系统［8，23-24］。
1.3CRISPR /Cas9 介导的打 靶 系 统 的应用
ZFN 和 TALEN 打靶技术是目前研究较为成熟的 2 种定点突变技术，但是这 2 种技术构建可识别特异位点的核酸酶较为繁琐，每一个位点需要构建2 个相应的核酸酶，而 CRISPR/Cas9 系统对特异位点的识别靠小的 crRNA 的引导，CRISPR 区可以有一系列的 crRNA 组成，每个针对特异位点的 crRNA只有几十个碱基，整个载体较小，相对于 ZFN 和TALEN 载体，更加容易构建[26]。每一串 pre-crRNA 中含有多个可对应不同的 DNA 识别位点的序列，而Cas9 可以通用，所以即使同时针对多个不同位点的打靶，也只需构建一个载体即可［11］。目前 Jinek 等发明了一种更新型的 CRISPR/Cas9 系统，将 crRNA和 tracrRNA 2 个序列通过一个 4 碱基的连接环连接起来，构成一个新的 guide RNA，相对于野生型的CRISPR/Cas9 系统，这种新型的系统更加容易构建，并具有相同的打靶效率［22]
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