开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
1 课题研究背景:
过氧化物还原蛋白（Peroxiredoxin, Prx）是一类结构高度保守的抗氧化蛋白超家族，在哺乳动物细胞中共有六个不同亚型的过氧化物还原酶（Prx 1到Prx 6），又可分为典型2-Cys（Prx 1到 Prx 4），非典型2-Cys（Prx 5）和1-Cys（Prx 6）三个亚族，具有保护细胞免受过氧环境的损伤的功能，尤其是对肺部气道具有保护作用。其中Cys52是其活性位点，在于过氧化物反应时，Cys52 （半胱氨酸）巯基脱氢形成分子间二硫键,硫氧还蛋白（thioredoxin）可还原二硫键重新生成还原态的Prx，继续发挥其抗氧化功能，从而还原氧化。过氧化物等除了可以引起Cys脱氢，也可引发蛋白质中L-氨基酸外消旋化（racemization）转化为D-氨基酸，这种外消旋化也是一种蛋白质翻译后修饰（post-translationalmodification,PTM）类型，以天冬氨酸的外消旋化为主，丝氨酸、谷氨酸次之。
蛋白质中L-氨基酸转化为D-氨基酸的这种外消旋化修饰会引起蛋白质空间结构和功能等的变化，可导致其回转半径、分子内氢键及高级结构等的变化，从而改变蛋白质活性、溶解性、稳定性等特征。蛋白质中L-氨基酸外消旋化产生的D-氨基酸在一些病变组织中较正常蛋白显著增加，因此蛋白质结构中D-氨基酸的产生可能与特定疾病的发生存在关联。近年来，体内、体外实验发现，蛋白质中氨基酸发生外消旋化受到自由基、pH、酶和温度等多种因素的影响。
目前，蛋白质中氨基酸外消旋化检测的难点主要由于D-氨基酸与L-氨基酸分子量完全一致，因此蛋白质组学分析中常用的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MADLI-TOF-MS）、液相色谱-质谱联用技术（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS）等方法都无法测定外消旋化这一PTM。近年来，关于蛋白质中氨基酸外消旋化程度及外消旋化位点评价方法的研究和应用众多，主要包括蛋白质酸水解后氨基酸的测定、蛋白质酶水解后肽段的测定以及蛋白质和多肽的免疫学测定。目前常用的外消旋化测定方法是分离目标蛋白质后，将目标蛋白经过传统的酸水解处理成游离氨基酸，然后手性衍生试剂柱前衍生HPLC法或手性HPLC法测定D/L-氨基酸比例并计算蛋白质中氨基酸的外消旋化程度。这些方法主要问题在于（1）酸水解过程通常在高温环境（100℃左右）中进行，处理一定时间则会引起蛋白质中氨基酸额外发生外消旋化，衍生化过程也可能导致外消旋化的发生，使测定结果略有偏差；（2）只能用于D-氨基酸总量测定，无法进一步确定D-氨基酸外消旋化修饰位点，特别是蛋白质活性中心、功能相关区域的外消旋化修饰程度无法评价；（3）需用纯化后的蛋白测定，生物样本纯化提取蛋白工作量较大。
与蛋白质酸水解后测定氨基酸相比，蛋白质酶水解后肽段的测定的条件比较温和，较低的反应温度、较短的酶解时间均不会引起蛋白质中氨基酸额外发生外消旋化；部分方法不仅可以评价外消旋化程度，还可以确定发生外消旋化的D-氨基酸的位点，对于进一步研究蛋白质结构改变对生理功能的影响具有重要的意义。但蛋白质酶水解后测定肽段的方法通常对质谱设备要求较高，不同蛋白质酶解肽段大小不同，分离难度差异大，测定也受到蛋白质在体内浓度水平的影响，因此不同特点的蛋白质应采用不同分析策略。
前期研究发现，Prx活性中心的肽段PLD46FTFVC52在体外模拟过氧化物环境中可迅速发生Asp46 的（天冬氨酸）外消旋化，24小时内其外消旋化修饰超过12%。因此，优化并建立简便易行的Prx外消旋化修饰的分析策略，研究其外消旋化修饰情况，对蛋白质外消旋化修饰的方法研究，具有重要意义。
2 拟研究或解决的问题：
建立简便易行的蛋白质外消旋化位点及外消旋化程度评价方法。
3 研究过程：
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