PAI单突变基因文库构建及酶活性筛选
摘要：共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid, CLA）因其良好的健康效益而被广泛研究了数十年。亚油酸异构酶可以特异地将LA转化为CLA异构体。天然来源的亚油酸异构酶活性较低，采用理性设计与定向进化相结合的方法对酶分子进行改造，选择几个优势突变位点，将突变限制在十几个特定的氨基酸残基之间，可以减少突变库容量，降低筛选工作量，达到提高其酶活的目的。
关键词：亚油酸异构酶； 半理性设计； 基因文库；酶活
一、文献综述
1.1共轭亚油酸
共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid,CLA）共轭亚油酸是亚油酸的几何和位置 (18:2,n-9) 异构体，具有抗肿瘤、抗氧化、抗动脉粥样硬化、减轻体重[1]等功能。2008年美国FDA、2012年欧洲国家将CLA纳入食品添加剂的范畴，我国2009年批准CLA为新资源食品，具有广泛的市场需求。因此，对于提高CLA产量方法的研究具有较大的应用前景及工业意义。许多科研者对其进行了广泛的研究，研究发现，CLA的合成方法主要分为天然来源、化学合成法和生物合成法[2]。
大量文献表明，最丰富的天然CLA来源于乳脂肪，但由于动物自身也需利用CLA，因此通过天然来源获得的CLA含量很低，不适合工业生产；通过低温碱异构化红花油等化学方法可以合成CLA，但其合成产物普遍为多种共轭亚油酸异构体混合物，很难分离出单一产物[3]；生物合成法是利用工程菌合成或催化生成共轭亚油酸[4]，因其反应所需条件较为温和，合成的CLA产物单一，且生理活性较高[5]，因此采用此方法可以有效的避免上述两种方法出现的问题。亚油酸异构酶对生物合成CLA起着重要的作用，受到越来越多研究者的关注。
1.2亚油酸异构酶
亚油酸异构酶（Linoleic Acid Isomerase）可以特异性的将亚油酸催化为共轭亚油酸异构体[6]，其中研究较为成功的为痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）来源的亚油酸异构酶[7]（PAI），其产生作用的机理如图1所示。
图1
1.2.1亚油酸异构酶催化合成CLA的研究现状
在目前对于生物合成CLA的研究中，采用的生物催化剂主要集中在野生亚油酸异构酶和突变亚油酸异构酶两种。张浩[8]等对保加利亚乳杆菌来源的亚油酸异构酶进行了研究，发现其能专一性地将LA转化为CLA，并且转化产物中活性异构体的比例达到了93.626%；
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