开题报告内容:(包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述,不少于2000字)
一、拟研究或解决的问题
比较红花注射液主要致敏物质0.04M、0.05M Tris-HCl-NaCl洗脱蛋白的免疫原性差异。检测在体免疫原性比较中的皮肤蓝斑直径;检测离体免疫原性比较中的beta;-氨基己糖苷酶释放率情况。综合在体与离体实验结果,比较红花注射液主要致敏物质免疫原性。
二、采用的研究手段
1.纯化蛋白在体免疫原性比较实验[26-30]
(1)抗血清制备:适应性饲养1周后,取SD大鼠14只,按体重分层随机分为:阴性对照组(5%GS,0.5ml/只,2只)、佐剂对照组(4%的氢氧化铝凝胶佐剂,0.5ml/只,2只)、牛血清白蛋白组(BSA 5mg/只,0.5ml/只,2只),红花注射液致敏蛋白组(根据红花注射液临床应用最高浓度20ml/250ml和制剂原液换算出等浓度蛋白作为本实验的给药浓度,分加佐剂致敏和不加佐剂致敏2个亚组)8只。各组大鼠分别按照0.5ml/只皮下注射给予5%GS、4%的氢氧化铝凝胶佐剂、BSA、红花注射液致敏蛋白(0.04M、0.05M洗脱部位),隔日一次,共致敏3次。末次致敏后第14天,戊巴比妥钠(20mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,腹主动脉采血,静置1~2h,3000r/min离心15min,分离血清,分装后冻存于-80℃超低温冰箱中,保存备用。
(2)被动致敏:另取健康SPF级大鼠适应性饲养后,按体重分层随机分为:阴性对照组(5%GS, 6只)、佐剂对照组(4%的氢氧化铝凝胶佐剂, 6只)、牛血清白蛋白组(BSA 5mg/只,6只),红花注射液致敏蛋白组(根据红花注射液临床应用最高浓度20ml/250ml和制剂原液换算出等浓度蛋白作为本实验的给药浓度,分加佐剂致敏和不加佐剂致敏2个亚组)24只。各组抗血清分别按照原液、1:2、1:8、1:32稀释后(以0.9%氯化钠生理盐水为稀释液),在大鼠背中线两侧脊柱约1.5cm处确定4个注射点进行皮内注射给药0.1ml/点被动致敏。
(3)药物激发:被动致敏24小时后,静脉注射与致敏剂量相同的激发抗原加等量的1%伊文思兰染料共1ml进行激发,激发注射30分钟后,各组大鼠以戊巴比妥钠(20mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,麻醉后腹主动脉放血安乐死,剪取背部皮肤,测量皮肤内层的斑点大小,直径大于5mm者为阳性。不规则斑点的直径为长径与短径之和的一半,并提供蓝斑照片,计算过敏反应发生率。
2.纯化蛋白离体免疫原性比较实验[31-35]
RBL-2H3细胞传代培养后,取对数生长期细胞,以1times;105/ml细胞浓度接种至96孔板中,100mu;l/孔,过夜培养。0.04M与0.05M分别设空白对照组、正常组、牛血清白蛋白(BSA)组、总酶组、血清稀释比1:32组、血清稀释比1:16组、血清稀释比1:8组,血清稀释比1:4组、血清稀释比1:2组、血清稀释比1:1组共10组。正常组、BSA组、血清稀释比1:32组、血清稀释比1:16组、血清稀释比1:8组,血清稀释比1:4组、血清稀释比1:2组、血清稀释比1:1组分别加入相应的致敏血清100mu;l/孔,空白对照组与总酶组分别给予等体积培养基,每组设6个复孔,培养24h致敏细胞后,弃培养液,以PBS清洗,去除残余血清,空白对照组与正常组每孔加入100mu;l培养基、BSA组每孔加入100mu;l BSA(10mg/ml)、血清稀释比1:32组、血清稀释比1:16组、血清稀释比1:8组,血清稀释比1:4组、血清稀释比1:2组、血清稀释比1:1组共10组。正常组、BSA组、血清稀释比1:32组、血清稀释比1:16组、血清稀释比1:8组,血清稀释比1:4组、血清稀释比1:2组、血清稀释比1:1组各加入100mu;l相应激发液,总酶孔加100mu;l 0.1% TritonX-100以完全溶解细胞,孵育1.5h,冰浴终止反应,4℃,1000r/min离心10min,收集上清。
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