脆弱拟杆菌荚膜多糖的提取及肠道免疫调节作用的研究文献综述

 2022-12-29 14:20:11

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

  1. 拟研究的问题

PSA是从脆弱拟杆菌荚膜多糖中提取出来的一种两性离子多糖，是介导宿主肠道免疫应答的一种共生因子。在GF小鼠中，PSA可诱导免疫系统的细胞和生理发育，纠正TH1/TH2细胞的失衡。PSA通过依赖tlr2的方式被浆细胞样树突状细胞(pDCs)识别，并通过主要组织相容性II类(MHCII)分子和共刺激分子(如ICOSL和CD86)来诱导Treg细胞。因此，psa诱导il -10的Treg细胞的形成可以预防结肠炎和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)等疾病[1]。本课题拟提取分离PSA，并通过构建DSS诱导的肠炎模型，验证PSA对于小鼠肠道炎症的调节作用及对肠道菌群的影响，进一步分析PSA影响调节性T细胞进而调节肠道免疫的具体途径。

  1. 文献综述

脆弱拟杆菌隶属于拟杆菌门, 拟杆菌科, 拟杆菌属。它的最初描述是从腹部溃疡导致阑尾炎的病灶部位所分离到的菌株, 是革兰氏阴性非生孢的杆菌, 不运动或以周生鞭毛运动, 代谢类型为化能异养菌, 能利用糖或蛋白胨。在人和动物肠道内定殖的厌氧菌群中，拟杆菌是优势菌，约占到肠道菌总数的1/4，对于维持宿主的健康状态不可或缺，尤其对于肥胖、糖尿病以及免疫缺陷疾病有着良好的治疗前景[8]。

在脆弱拟杆菌的表面具有多种荚膜多糖，其中表面荚膜多糖A（PSA）对宿主有益生作用。PSA是由重复的四糖单位组成，平均分子大小约为130 kDa。每个重复单元的两性离子性质来自一个带正电荷的游离氨基和一个带负电荷的羧酸盐[2]。其免疫学途径是由浆细胞样树突状细胞识别，经过APC细胞的处理，由MHC2途径在细胞表面对CD4 T细胞进行提呈，使CD4 T细胞分化成为有抑制性作用的调节T细胞，然后分泌IL-10细胞因子对抗IL-17产生的炎症反应。

研究者以无菌老鼠为实验模型,发现无菌老鼠的CD4 T细胞发育欠佳,当移殖缺少PSA的脆弱拟杆菌到无菌老鼠体内时.CD 4T细胞的发育水平几乎与无菌老鼠一样差,而移殖野生型脆弱拟杆菌到无菌老鼠体内时，CD4 T细胞的水平恢复到正常值.这就表明带有完整PSA的脆弱拟杆菌校正了无菌老鼠的免疫缺陷,具体表现在PSA激活了对免疫反应至关重要的CD4 T细胞,并且调节了Th1 (T helper 1)和Th2 (T helper 2)细胞之间的平衡关系,这对于免疫系统发育以及稳态的维持必不可少。此外, PSA可以抑制由于肠道菌群平衡破坏而引起的肠炎的发生, 2008年Mazmanian等以由于肝螺杆菌感染而患结肠炎的动物为实验模型,证明肠道中的共生菌--脆弱拟杆菌可阻止这一肠炎的发生. 这是因为脆弱拟杆菌可作为免疫激活剂激活调节性T-细胞，后者通过分泌L-10 (Interleukin- 10)达到有效抑制促炎因子1L-17 (Interleukin- 17)的目的.从而抑制肠炎的发生。2010年Ochoa- Reparaz等研究表明宿主体内的PSA通过间接诱导儿-10的分泌达到预防中枢神经脱髓鞘类疾病的目的.如脑脊髓炎(Encephalomyelitis)。2011年 Round等的研究成果显示定殖在粘膜表面的脆弱拟杆菌.通过释放PSA激活Toll-likle receptors (TLR)途径这有助于免疫系统正确识别致病菌与非致病菌.保护宿主的健康。

在研究者[1]对PSA免疫调节的分子机制的研究中，PSA的先天免疫和适应性免疫都需要TLR2。而TLR2对于细胞因子的产生和APC中PSA表达(如iNOS、MHCII和CD86)的基因的诱导是必要的。PSA减轻肠道炎症的过程中需要pDC表达ICOSL、CD86和MHCII分子，这些分子直接导致pDCs和CD4 T细胞之间的同源相互作用，从而诱导IL-10的产生和对TNBS结肠炎的保护。此外，TLR2还介导了CD39 CD4 T细胞在PSA作用下的扩增。

  1. 研究手段
    1. PSA的提取

适宜条件下对脆弱拟杆菌进行培养，用热酚/水萃取法对处理过的菌液进行萃取，分离得到脆弱拟杆菌的荚膜复合物。对复合物进行标准酸处理（5%醋酸，100℃，1小时），然后用阴离子交换色谱法进行分离。荚膜复合物溶解在Ph为7.3的Tris缓冲液中，通过DEAE-Sephacel柱层析分离，在此条件下PSA可以通过阴离子交换柱，而PSB则被保留在柱中（后续可以用高摩尔浓度的NaCl缓冲溶液进行洗脱）[2]。

    1. 动物模型的构建

通过给予4%（或5%）的葡聚糖硫酸钠（DSS）自由饮水7d来诱导构建小鼠的肠炎模型，对照组引用生理盐水[9,10]。

    1. 抗原特异性细胞的检测

用流式细胞仪对抗原特异性细胞进行检测，对CD4、CD25等相关分子荧光染色并检测观察分析[5]。

    1. 以PSA对于DSS诱导的肠炎模型的研究

在已有文献中，研究者[3]进行了PSA对气道炎症的影响的研究，他们在试验中应用的PSA为溶解于生理盐水口服给药100g/剂，超过12天，本课题实际采用的实验方法有待讨论。

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