基于非天然氨基酸的光控蛋白质降解文献综述

 2023-02-13 22:32:46

1. 拟研究或解决的问题本课题旨在通过非天然氨基酸的定点引入以及tmRNA介导的质量控制系统实现蛋白质的可控降解。

2. 研究内容及研究手段2.1验证可实现的光保护酪氨酸ONBY定点引入：通过共转pBAD-GFP（149TAG）与MM-3质粒，在添加IPTG和阿拉伯糖诱导时添加光保护酪氨酸ONBY，避光培养并在激发条件下检测是否存在绿色荧光。

2.2验证被ssrA标签标记的蛋白质是否可被高效降解：通过构建pBAD-eGFP-ssrA与pBAD-eGFP-ssrA（失活），pBAD-eGFP三种质粒进行对照，确定被具有天然活性的ssrA标签的eGFP可以显著被降解，确定ssrA标签降解蛋白质的功能活性。

2.3 验证引入ONBY的ssrA标签可以通过光控实现可控蛋白降解：通过构建pBAD-eGFP-ssrA（Y7TAG）质粒和MM-3共转，在诱导剂和ONBY的存在下进行避光诱导表达再进行光诱导降解，与pBAD-eGFP-ssrA与pBAD-eGFP-ssrA（失活）形成对照，确定光诱导可以实现模式蛋白质的可控降解3.主要研究方法3.1表达载体的构建点突变3.1.1引物设计正反向扩增引物5端包含15-21 bp反向互补区域(GC含量40%-60% 为佳），各引物非互补区域长度至少为15 bp。

所需引入突变可以包含在互补区域内（需要两条引物上均引入点突变），也可以包含在任一条引物的非互补区域（仅一条引物引入突变）。

引物设计好后送由公司合成。

3.1.2 PCR扩增以实验室前期构建的pBAD-eGFP-ssrA-Spycatcher为模板，设计50uL PCR体系；包括模板，正反向引物，dNTP，Buffer，DNA Polymerase，ddH2O。

按照预变性，高温变性，低温结合，中温延伸，循环，补齐末端的程式确定PCR条件并摸索合适的温度时间。

最后获得PCR产物。

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