大鼠肝脏线粒体的体外功能评价及对其损伤研究文献综述

 2023-02-17 20:39:34

一、拟研究概况

作为细胞能源工厂的线粒体（mitocbondria）是机体细胞中重要的亚细胞器，它具有独特的超微结构和多种重要的生物学功能。

本课题选择肝脏线粒体作为研究载体，因为肝脏是药物代谢、转化的最重要的器官。药物引起的肝损伤是临床上具有挑战性的研究领域，通过肝脏线粒体研究药物对机体的毒性或保护作用具有重要意义。此外，国际上近1/4的线粒体研究采用肝脏线粒体作为研究对象（数据来源：NIH pubmed databas），且实验动物肝脏线粒体的制备和功能测定相对简便可靠。因此本研究也采用肝脏这个器官作为线粒体样本的来源。

本实验对大鼠离体肝脏线粒体的功能评价主要通过测定线粒体膜电位和线粒体通透性转换孔道的开放程度实现。线粒体膜电位(mitoehondrial transmembrane potential，Delta;Psi;)是亚细胞器中膜电位最高者，一般为-150至-180 mV(内膜内侧为负)。这种膜电位促进质子内流来促使合成ATP，并维持线粒体的离子稳态，是线粒体氧化磷酸化功能正常的特征指标。线粒体通透性转换孔道(mitoehondrial permeability transition pore，mPTP)则是一种在特定条件下开放、并允许lt;gt;的分子自由通过的蛋白质复合物，其开放程度决定了线粒体膜的通透性，是线粒体受损、引起细胞凋亡的重要特征。线粒体膜电位和线粒体通透性转换孔道是线粒体功能极具代表性的评价指标，因此本实验选取以上两种指标评价线粒体功能。

对大鼠离体肝脏线粒体损伤的研究是借助上述指标，观察四种柴胡皂苷（a,b2,d,c）对大鼠肝脏线粒体功能的损伤作用。柴胡皂苷（saikosaponin，SS）的毒性作用是在临床应用过程中逐渐被发现的，其毒性靶器官主要为肝脏。孙蓉 等研究发现长期给予大鼠柴胡皂苷，可致肝功指标的改变，肝细胞器质性病变，并指出其导致大鼠肝毒性损伤途径与氧化损伤机制密切相关，而氧化损伤与线粒体损伤是密不可分的。研究发现柴胡皂苷d诱导LO2细胞调亡的机制主要是通过影响了PDGF-pR/p38 MAPK信号通路，进而损伤细胞线粒体正常功能，激活下游调亡级联反应，导致细胞调亡。此外，Fas信号通路也积极参与了柴胡皂苷d诱发肝细胞的调亡过程，其主要是通过caspase-8信号的激活切割了细胞内的bid，使其转变为tBid，进而将凋亡信号传递至线粒体，诱发线粒体调亡信号通路的激活。总结以上研究成果，线粒体是柴胡皂苷毒性作用的潜在靶点,研究柴胡皂苷（a,b2,d,c）对大鼠肝脏线粒体功能的损伤能够为柴胡肝损伤机制研究提供依据。

本课题以亚细胞水平的病理生理学为指导，以离体肝脏线粒体为研究载体，借助分光光度法和Rhodamine123荧光法的评价指标，测定线粒体通透性孔道和线粒体膜电位，进而评价线粒体功能，在线粒体水平研究柴胡皂苷的毒性作用机制。

二、研究方法

制备线粒体是采用肝组织匀浆悬液介质中进行分步差速离心的方法。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集，获得线粒体。

对采用分步差速离心的方法得到的线粒体进行功能评价，采用的实验方法是Rhodamine123荧光法测定线粒体膜电位和分光光度法测定通透性孔道。

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