重组表达载体Anti- TNFα-VHH- pPIC9K的构建及其在毕赤酵母表达文献综述

 2023-02-18 19:56:01

开题报告内容：

一、研究目的及意义

肿瘤坏死因子alpha;(TNFalpha;)是一种在多种生物效应中起作用的细胞因子，属于TNF超家族成员[1]，它是最重要的炎症介质之一，TNFalpha;是一种跨膜蛋白，是由17 kDa的可溶型前导肽经TNFalpha;转化酶切掉信号肽后而形成17 kDa的成熟蛋白。TNFalpha;主要由活化的巨噬细胞分泌，也在许多肿瘤细胞分泌，例如纤维母细胞、星形胶质细胞、可扑弗氏细胞、平滑肌细胞、角化细胞以及包括 B细胞淋巴瘤、乳腺癌、黑色素瘤在内的多种肿瘤细胞。TNFalpha;作为肿瘤微环境中最主要的细胞因子，它能够调节其他炎症因子与趋化因子的表达，并能够影响多种癌症标志，包括刺激肿瘤细胞的增殖、存活、侵袭、转移，刺激炎症细胞异常化，诱导血管生成等[2-3]。因此，开发以TNFalpha;为靶标的抗肿瘤药物具有重要意义。由于多种TNFalpha;阻断剂已经成功用于治疗炎症疾病，用这些药物来治疗恶性肿瘤具有巨大潜力。

纳米抗体(nanobody, Nb)是近年来发现的一种新型抗体，即重链单域抗体VHH骆驼体内存在着天然缺失轻链的重链抗体，克隆其可变区而得到的只由一个重链可变区组成的单域抗体，具有相对分子质量小、稳定性强、可溶性好、抗原结合性能好、易表达及免疫原性低等特点， 较常规抗体用途更广[4]。纳米抗体作为一种新型抗体在基础研究、新药开发以及疾病的诊断和治疗以及食品科学领域具有广阔的应用前景。基于TNFalpha;在肿瘤发展中的重要作用及 TNFalpha;纳米抗体的小型化抗肿瘤优势，本实验利用已经获得的抗TNFalpha;纳米抗体（Anti-TNFalpha;-VHH）序列构建表达载体进行抗TNFalpha;纳米抗体蛋白的表达。由于在传统的基因工程技术中，原核表达系统是常被研究基因功能的成熟系统，但原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完善等缺陷。真核表达系统具有蛋白加工、折叠、翻译后修饰等优点。而毕赤酵母比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其他真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以致百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。所以采用酵母表达系统表达Anti-TNFalpha;-VHH蛋白并对其活性进行研究及对肿瘤靶向治疗的临床应用有着重要意义。

二、研究方法和手段

1、研究方法：

1）构建Anti-TNFalpha;-VHH毕赤酵母重组表达载体：

以Anti-TNFalpha;-VHH基因为模版，通过上下游引物扩增Anti-TNFalpha;-VHH基因片段。Anti-TNFalpha;-VHH扩增产物和pPIC9K载体分别用EcoR I与Not I进行双酶切，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收Anti-TNFalpha;-VHH目的片段和pPIC9K载体，并在16C过夜连接载体和目的片段，连接产物通过化学方法转化到大肠杆菌DH5alpha;中。涂布在含氨苄（100mu;g/ml）的LB培养基筛选阳性克隆，挑取阳性克隆接种入液体LB培养基使其大量扩增（37℃培养12h）。通过菌落PCR筛选阳性克隆，并提取质粒进行酶切和测序鉴定。

2）重组表达载体Anti-TNFalpha;-VHH- pPIC9K在毕赤酵母中的转化与筛选：

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