中华眼镜蛇毒液的分离纯化与靶向疼痛靶点TRPV1的活性筛选文献综述

 2022-12-09 14:54:12

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、实验背景

蛇毒作为开发临床药物的天然宝库，引起越来越多科研人员的关注。蛇毒是由蛇的毒腺分泌的多种组分构成的复杂混合物，其干物质中蛋白质占90%，也是毒性和生物学活性的主要成分，应用于多种疾病的治疗。疼痛是由体内、外伤害性刺激引起的一种复杂的心理生物学过程。在疼痛的研究中发现多肽类蛋白质在基础研究和临床应用中扮演着重要的角色。早期研究表明，中华眼镜蛇毒液具有强于吗啡的镇痛活性，并能产生持续性的镇痛效应。然而，中华眼镜蛇毒液的镇痛活性组分与调控疼痛靶点机制尚未得到深入探究。

电压门控离子通道是细胞膜上一类重要的跨膜蛋白,在许多生理进程中期这至关重要的作用,包括肌肉收缩、神经元间的电信号传递和心脏中的兴奋扩散等。离子通道阻断剂为研究离子通道的结构与功能关系提供了很好的工具。在动物毒液中发现了大量的钾通道毒素,按作用机制主要分为两大类电压门控调制毒素和孔道堵塞毒素。电压门控调制毒素通过与电压门控通道上的电压敏感元件结合进而改变通道的门控特征来抑制通道电流。孔道堵塞毒素通过直接插入离子通道的孔道内部从而阻断离子电流。近年来,离子通道作为药物研发的靶点倍受关注。因其功能的异常可能对细胞功能及信号转导产生巨大影响,且是可以与小分子药物高度亲和的少量蛋白质之一(其他包括酶,G蛋白偶联受体和核激素受体),离子通道成为了非常有价值的药物靶点。但早先基于离子通道的药物研发与针对其他药靶的药物相比存在着一定差距。幸运的是,最近几年学术界和产业界均不断发现和鉴定出了许多新的可用于药物靶点的离子通道。而且药物筛选和结构鉴定的技术不断进步,使得研发新的离子通道药物更加快捷。众多瞬时受体势通道(TRP)的发现为人们带来了巨大的惊喜,TRP不但是感觉信号的调节因素,而且也因其成为了最新的药物靶点扩展了传统离子通道药靶范围,为研发与癌症、免疫病变等相关药物带来新的希望。

TRPV 1受体在体内分布极为广泛。首先发现TRPV 1在背根神经节和三叉神经节上小直径的神经元亚群中表达,后来发现在许多神经元细胞和外周非神经组织上也有表达,并且在感觉神经元上高度表达。不同的脑区域包括下丘脑、小脑、大脑皮质、中脑、嗅球、海马中也都发现含有TRPV1。研究发现TRPV 1在许多疼痛传导途径的上游区调节,因此TRPV 1成为治疗疼痛的新靶点。辣椒碱是最早发现的TRPV 1激动剂,原先发现辣椒碱等TRPV 1激动剂会促使痛觉增敏,但是后来发现脱敏剂量的辣椒碱能够抑制疼痛。作为局部镇痛药物,辣椒碱已经被收入美国药典。但是应用辣椒碱会产生一些不良反应,如局部使用辣椒碱会有灼热感、数天至几星期后会导致痛觉丧失以及对各种有害刺激失去反应。因此研究TRPV1拮抗剂可能比激动剂更具有临床应用性。

二、研究手段

1：中华眼镜蛇毒液的分离纯化：采用阳离子交换层析与反相高效液相色谱结合来分离纯化中华眼镜蛇毒液。第一步,阳离子交换层析将中华眼镜蛇粗毒10mg用2ml双蒸水溶解,12000转/min离心10min后弃去不溶物,取上清液进样,在配备有486紫外检测器的Waters 650 E高级蛋白质纯化系统上,采用Waters CM(300nm)填料,使用常压自装柱（10mmtimes;100mm）进行阳离子交换层析。第二步,反相高效液相色谱分离脱盐纯化在Pharmacia公司的AKTA蛋白纯化系统上完成,采用大连依利特公司的C18反相制备柱。一次进样200~400ml。先用100%双蒸水（含0.1%TFA）冲洗20min,将混在样品中的盐冲洗干净（紫外检测吸收值为零）之后,用乙睛（含0.1%TFA）溶液进行梯度洗脱。流速为3.0ml/min,检测波长为280/215nm,柱温为室温。收集每个洗脱峰,用质谱鉴定它们所含成分的分子量,将洗脱峰进行冷冻干燥。最后,目的样品再在反相纯化系统（Waters公司，Alliance 2690HPLC amp; Millennium32 高效液相色谱工作站，996PDA检测器，或者Waters 515 pump amp; empower高效液相色谱工作站,2487检测器）上进行纯化，分离柱：为Phenomenex C18柱（4.6mmtimes;250mm）；洗脱液分别为：A液（0.1%TFA/H2O）、B液(0.1%TFA/CAN),流速为0.7ml/min,检测波长为280/215nm,柱温箱温度为40℃。收集洗脱峰,并用MALDI-TOF质谱仪鉴定样品的纯度,目的样品的冻干粉末置于-20℃冰箱储存备用。

2：电生理技术与药理学的结合为研究离子通道的功能提供了最准确最直接的方法, 其优点是检测灵敏,无放射性污染,可在精确时间分辨率下读数。因该技术必须通过钳住细胞膜来记录电流量,因此是唯一可直接记录单通道功能的方法, 而成为了检验离子通道功能的经典技术。但该方法也有许多固有的缺点,它是低通量的技术(一次实验一个细胞),需要具有专门技术的高度熟练技术人员才能操作,除标准实验室配备外需配置专门设备, 而且技术和设备需随实验细胞类型的不同而改变,如卵母细胞电生理与哺乳动物细胞膜片钳方法的技术和设备需要就有所不同。因此,传统电生理技术不适用于大量化合物库的高通量筛选。而后包括自动电生理技术,二维膜片钳等新技术的不断涌现提高了基于离子通道药靶直接筛选药物的通量, 可理论上克服传统技术的壁垒, 如 IonWorks (Molecular Devices), PatchXpress (Molecular Devices)等。

三、参考文献

【1】丁晓兰, 等. 中华眼镜蛇毒口服给药镇痛作用的研究—抗感染药学 Anti Infect Pharm 2013 September;10(3)

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