化合物AAA的遗传毒性研究——Ames实验文献综述

 2022-12-10 14:55:21

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

Ames实验，即污染物致突变性检测，也称为鼠伤寒沙门氏菌回复突变实验(Ames实验) 。

污染物对人体的潜在危害，引起人们的普遍关注。世界上已发展了百余种短期快速测试法，检测污染物的遗传毒性效应。B．N．Ames等经十余年努力，于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变实验（亦称Ames试验）已被世界各国广为采用。该法比较快速、简便、敏感、经济，且适用于测试混合物，反映多种污染物的综合效应。

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的组氨酸营养缺陷型（his－）菌株，在含微量组氨酸的培养基中，除极少数自发回复突变的细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。某些化学物质需经代谢活化才有致变作用，在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶，可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关，故此法现广泛应用于致癌物的筛选。

Ames试验的常规方法有斑点实验和平板掺入实验。

  1. 菌株鉴定 用于测试的菌株，需经基因型和生物学性状鉴定，符合要求才能投入使用。 目前推荐使用的一套菌株是TA97、TA98、TA100和TA102。鉴定前先进行增菌培养。为鉴定结果可靠，需同时培养野生型TV菌株，作为测试菌基因型之对照。增菌培养用牛肉膏蛋白胨液体培养基，接种后于37℃，100r／min振荡培养12h左右，细菌生长相为对数期末，含菌数应为1times;109个／ml～2times;109个／ml。鉴定项目：（1）脂多糖屏障丢失（rfa）用接种环或一端挠起的接种针以无菌操作术取各菌株的增菌培养液，在营养琼脂平板上分别划平行线，然后用灭菌尖头镊夹取灭菌滤纸条，浸湿结晶紫溶液，贴放在平板上与各接种平行线垂直相交。盖好皿盖后倒置于37t温箱，培养24h-48h后观察结果。（2）R因子鉴定 划线接种，贴放滤纸条及培养等均同上，唯滤纸条浸湿的药液不同，为氨苄青霉素钠溶液。TA102除pKM101外，还有pAQ1，载有抗四环素的基因，故另用滤纸条浸湿四环素溶液后贴放于划线接种的平板上。（3）紫外线损伤修复缺陷（△uvrB）在营养琼脂平板上按上述方法划线接种后，一半接种线用黑玻璃遮盖，另一半暴露于紫外光下8sec，然后盖好皿盖并用黑纸包裹平皿，防止可见光修复作用。培养同上。（4）自发回变 预先制备底平板；向灭菌并在水浴内保温45℃的上层软琼脂中注入0.1ml菌液；混匀后倾于底平板上并铺平。平皿倒置于37℃温箱培养48h。（5）回变特性——诊断性试验 上层软琼脂中除菌液外，还注入已知阳性物之溶液，需活化系统者并加入S9mix，余同上。组氨酸营养缺陷型由自发回变即可知。

2.斑点实验 吸取测试菌增菌培养后的菌液0.1ml，注入融化并保温45℃左右的上层软琼脂中，需S9活化的再加0.3ml－0.4mlS9mix，立即混匀，倾于底平板上，铺平冷凝。用灭菌尖头镊夹灭菌圆滤纸片边缘，纸片浸湿受试物溶液，或直接取固态受试物，贴放于上层培养基的表面。同时做溶剂对照和阳性对照，分别贴放于平板上相应位置。平皿倒置于37℃温箱培养48h。在纸片外围长出密集菌落圈，为阳性；菌落散布，密度与自发回变相似，为阴性。

3.平板掺入实验 将一定量样液和0.1ml测试菌液均加入上层软琼脂中，需代谢活化的再加0.3ml－0.4ml S9mix，混匀后迅速倾于底平板上铺平冷凝。同时做阴性和阳性对照，每种处理做3个平行。试样通常设4个～5个剂量。选择剂量范围开始应大些，有阳性或可疑阳性结果时，再在较窄的剂量范围内确定剂量反应关系。培养同上。同一剂量各皿回变菌落均数与各阴性对照皿自发回变菌落均数之比，为致变比（MR）。MR值ge;2，且有剂量-反应关系，背景正常，则判为致突变阳性。

AAA属于维生素B类化合物，文献报道，AAA对白内障、心脏病、糖尿病、局部缺血再灌注损伤、重金属中毒、放射性损害、退行性神经病变及艾滋病感染具有预防和治疗效果。目前临床上主要用于治疗糖尿病周围神经病变，已上市注射液临床用法为：静脉注射或滴注。静脉注射时最大速度为每分钟50 mg AAA（相当于2 mLAAA注射液）。如将250-500mg AAA（相当于10-20 mLAAA注射液）加入100-250 mL生理盐水中进行滴注，静脉滴注时间约30分钟。对于严重患者可用静脉注射300-600 mg/天（约12-24 mL/天）治疗。不良反应包括在静脉滴注过快时偶见头晕、头胀和呼吸困难，极个别患者可出现抽搐、紫癜和血小板功能异常引起的出血倾向。另外还可偶见输注部位疼痛、静脉炎、针刺样疼痛等情况。因斑点实验只局限于能在琼脂上扩散的化学物质，大多数多环芳烃和难溶于水的化学物质均不适用，此法敏感性较差，主要是一种定性试验，适用于快速筛选大量受试化合物。而平板掺入实验可定量测试样品致突变性的强弱。此法较斑点实验敏感，故本实验采用平板掺入法进行化合物AAA遗传毒性的研究。

本实验的主要成果形式是研究性报告。

参考文献：

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