侵袭性真菌抗原的制备研究文献综述

 2022-12-20 22:33:44

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

  1. 实验目的和意义

随着各种细胞毒类药物、免疫抑制剂、广谱抗菌药物等的广泛应用，器官移植、造血干细胞移植等的广泛开展，各种侵入性操作以及获得性免疫缺陷综合征患者的不断增多因素，使得侵袭性真菌病（Invasive fungal disease,IFD）的发病率逐年上升[1，2].IFD常发生于免疫力低下的患者，其病情进展迅速，死亡率高达50%[3，4]。新的血清学检测方法如G试验、GM试验等快速发展，且其具有早期、快速、方便、非侵入性等优点，已成为目前诊断IFD研究领域的焦点，己被国内外IFD诊断和治疗指南列为临床诊断IFD的微生物学标准之一[5]引起侵袭性真菌病的常见病原菌为烟曲霉、念珠菌、隐球菌等[6]。本课题就是通过提取侵袭性真菌的抗原来制备相应的抗体来进行快速检测。

对于制备多糖特异性抗体（尤其是鼠源性单抗）来说，动物的免疫效果是关系到能否获得特异性抗体的关键环节。动物免疫是一个重复多次的过程，合理的免疫方案虽然能在一定程度上提高免疫效果，增加抗体的滴度，但抗原的免疫原性是决定免疫效果好坏的根本因素。因此如何提高多糖的免疫原性是整个多糖特异性抗体制备过程中极为关键的问题。

  1. 实验内容
  2. 念珠菌

将白色念珠菌菌株接种到沙氏肉汤培养基，放到恒温培养振荡器中 35℃振荡培养 18 h，将培养得到的白色念珠菌用台式离心机离心（2500 r／min）15 min，然后倒出上清液，收集白色念珠菌，再进行烘干，得到干燥的白色念珠菌。

称取10g干燥的白色念珠菌悬浮于100ml（1mol／L）的NaOH溶液中，100℃下剧烈搅拌1 h， 冷却离心后去上清，不溶物用NaOH溶液重新悬浮，直接加热至100℃维持15 min，离心冷却后用HCl调pH至4.5，蒸馏水洗2次，无水乙醇分2次脱水，再用20 ml无水乙醚脱水，室温风干得碱不溶性葡聚糖。称取5g碱不溶性葡聚糖悬浮于乙酸溶液中，100℃保持3 h且剧烈搅拌，冷却后用1mol／LNaOH调pH至4.5，蒸馏水水洗3次，再用100 ml无水乙醇分两次脱水，最后用100 ml无水乙醚脱水，室温风干12h得酸碱不溶性葡聚糖[7]。

  1. 曲霉菌

将烟曲霉菌种接种于沙氏平板上，37℃培养4 d后，挑选单菌落，转接至培养基中，37℃震荡培养7d，以0.22um无菌滤器将培养液中真菌的菌丝体(含极少量的孢子)和菌液分隔开。

烟曲霉细胞壁抗原成分的制备将菌丝体重悬于3.7％甲醛-生理盐水，置4℃、24 h，灭活的菌丝体以预冷生理盐水洗6遍，置超声粉碎仪中彻底破碎菌体胞壁，经10000r／min，30 min离心，收集上清，置-80℃备用[8]。

  1. 隐球菌

从沙氏平板上挑取单个菌落,分别接种至250mL酵母氮源基础培养液中,置于摇床30℃以1 00r/min摇菌培养4-5d。增菌培养液121℃高压灭菌15min,5 000 r/min 离心 20 min,弃沉淀,收集上清液。荚膜多糖的分离于上清液中缓慢加入3倍体积的无水乙醇,溶液出现牛奶样白色沉淀,摇匀后置4℃过夜。次日于5000r/min离心10min收集沉淀,弃上清,风干沉淀。

后续根据具体实验情况调整试剂用量、培养时长等条件，以得到更优方案。

三、文献综述

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