小豆蔻明抑制p53突变型细胞增殖及机制研究文献综述

 2022-12-24 13:32:29
  1. 研究目的

通过研究小豆蔻明作用下，结肠癌细胞活力、增殖能力、细胞周期以及相关凋亡蛋白表达水平的变化，明确CAR对p53突变型细胞增殖的作用，并进一步探讨其具体作用机制。

  1. 研究内容和方法
    1. 采用CCK-8实验检测不同浓度CAR（0、10、20、30、40、50、60、70、80、100、120mu;M）对结肠癌细胞DLD-1、SW620活力的影响。
    2. 采用Annexin V/PI双染法流式细胞技术检测不同浓度CAR（0、20、40mu;M）诱导DLD-1、SW620凋亡细凋亡的影响。
    3. 采用流式细胞技术检测不同浓度CAR（0、20、30mu;M）对细胞周期的影响。
    4. 采用Western Blot检测不同浓度CAR（0、20、30、40mu;M）作用下，DLD-1、SW620突变型p53蛋白表达的变化。
    5. 采用qRT-PCR检测不同浓度CAR（0、20、40mu;M）作用下，DLD-1、SW620的p53、p21、gadd45、14-3-3sigma;、cdk1、ccnb1基因表达量的变化。
  2. 主要成果形式

实验数据（图）及理论总结。

  1. 课题工作进度
    1. 3月20日——4月中期检查 查阅文献，进行实验，统计实验结果；
    2. 4月中期检查——5月20日 分析数据，提交论文初稿；
    3. 5月20日——5月28日 论文修改与完善，上传终稿。
  2. 文献综述
  3. 癌症与细胞凋亡

癌细胞的增殖源于它能避免细胞的程序性死亡(Programmed Cell Death, PCD)，即避免细胞凋亡的能力。人类caspase蛋白家族是一组含半胱氨酸的天冬氨酸水解酶[1]，常以无活性的酶原形式存在于体内，可特异性切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键。在特定位置切割caspase使其激活后将引起细胞凋亡蛋白级联瀑布反应，促使细胞凋亡。

诱导癌细胞凋亡是治疗癌症的手段之一。目前，诱导细胞凋亡主要有内在途径和外在途径两种。内在途径即线粒体介导的凋亡途径，受Bcl-2家族的调控，活化的Bax和Bak通过促进Cyt C的释放并激活caspase-9，刺激效应caspase-3的生成，从而调节细胞凋亡。外在途径即通过死亡因子（DR）介导凋亡，特异性死亡受体与死亡因子结合后，活化Fas相关死亡域蛋白（FADD）并形成可激活下游caspase的细胞凋亡诱导信号复合体（DISC）[2]。此外，还包括内质网应激和自噬等途径。

  1. Tp53基因与p53蛋白
    1. Tp53基因

位于17p13.1号染色体上的TP53基因是人类癌症中最常见的突变靶点。尽管p53突变类型随着肿瘤类型的不同而有所差异，大量研究显示，有超过一半的肿瘤在这个位点出现突变[3]。

    1. P53蛋白

P53蛋白不是一个单独的蛋白质。Tp53基因编码了9种氨基端与羧基端组合不同的同工酶[4]。与p53相似，p63、p73作为p53家族成员，作用类似，且作为与突变体p53相互作用的伴侣被广泛研究。突变型P53的核心结构域参与p63和p73的调控，突变型p53的“功能获得”部分源于其抑制p63/p73的功能[5]。

      1. 野生型p53及其诱导细胞周期停滞的机制

P53是一种序列特异性转录激活因子，许多P53靶基因编码参与调控细胞凋亡或细胞周期的蛋白。靶基因与p53上游应答原件结合后被反激活，产生编码蛋白，从而发挥其抑癌作用。P53 应激可被DNA损伤、异常生长信号触发、化学治疗药物及紫外线和蛋白激酶抑制剂诱导，对于不同刺激的应答很复杂。

p53阻滞G2/M的一种机制是通过细胞周期蛋白依赖性激酶Cdc2的调节[6]，而激活Cdc2需要通过激酶CDK1与Cyclin B（CCNB1）结合并磷酸化苏氨酸161[7]。这些p53靶点包括直接抑制cdc2的p21、14-3-3sigma;、Gadd45。

P21诱导细胞周期停滞主要取决于其抑制CDK1和CDK2的能力。在用四环素诱导P21的实验中，研究发现人类Hela宫颈癌细胞、Saos-2和U2OS骨肉瘤细胞、RKO大肠癌细胞、H1299肺癌细胞、小鼠1纤维细胞均停留在G2[8];[9];[10]。P21在细胞周期中的含量和位置也证明了它与细胞周期停滞相关[11]。p21可以通过直接结合CDK- Cyclin复合物来抑制CDK1活性[12]、抑制CDK2[13]、结合CDK2并干扰CDK1对Cdc2的磷酸化[14]来抑制Cdc2，也可以结合增殖细胞核抗原PCNA使其失活从而在S期引起DNA损伤，激活Chk1和Chk2激酶从而磷酸化Cdc25，使其与14-3-3sigma;结合，从而将Cdc25锚定在细胞质中，通过非p53依赖性机制抑制Cdc2[15]。而P21对于cdc2的抑制将最终引起G2阻滞。

Gadd45对于G2/M的组织可能源于其解离Cdc2/Cyclin B1复合物的能力，其对Cdc2的调节在维持基因组稳定性中起到重要作用。

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