一、课题背景
药物靶标的发现和验证是新药研发的基础,也是药物筛选及药物定向合成成败的关键因素之一。近年来，分子生物学技术的出现和发展，尤其是基因组学、生物信息学、蛋白质组学、质谱联用技术等推动了以细胞内生物大分子为目标的药物靶标发现进程。但如何综合运用多种研究方法发现和确证药物靶标仍是目前面临的重要挑战。
小分子药物在人体内与特定的靶蛋白结合，影响靶蛋白构象或功能，从而调控相关通路,是药物发挥作用的基础。因此，小分子药物的靶标发现是理解药物作用模式和疾病机制研究的关键步骤。目前，已经开发了多种方法用于小分子靶标发现与确证，如亲和色谱、同位素示踪法和紫外及荧光光谱等，其中亲和层析法应用广泛，例如通过该方法已发现免疫抑制剂他克莫司（FK506）的靶蛋白FKBP12、环孢菌素的靶蛋白亲环蛋白、沙利度胺致畸的靶蛋白羟脑基脂等[1]。但基于亲和层析法的药物靶标发现需对小分子药物进行衍生化[2]，如添加生物素或荧光素等标签等，可能使其结合特异性或亲和力发生改变，导致假阳性结果出现，限制了该方法的应用。与亲和层析法不同，药物亲和致靶点稳定性（drug affinity responsive target stability, DARTS）是无需对目标药物进行化学修饰的药物靶标发现经典方法之一，2009年由Lomenick[3]等首次提出。DARTS利用靶蛋白与药物结合后构象发生变化，对水解酶稳定性增加的原理[3-4]，检测药物结合前后蛋白水解效率的变化，可以快速和直接地识别小分子药物的潜在靶蛋白。此外，该方法与生物体系兼容性高，检测通量高，可在复杂生物基质背景下快速灵敏筛选药物可能靶蛋白，。现已应用DARTS成功鉴定小分子药物的靶蛋白，如Robinson等采用高通量筛选方法，筛选抑制多种三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）细胞生长的化合物双硫仑（disnlfiram），之后通过DARTS实验，揭示了双硫仑直接作用的靶标为含IO基序的GTP酶激活蛋白1和肌球蛋白重链9[6]；Chin等通过DARTS 实验发现alpha;-KG的作用靶标为ATP合成酶的beta;亚基，揭示了alpha;-KG这一关键代谢物介导长寿的机制[7]。DARTS方法包含以下步骤[5]，首先将药物与纯化的候选靶蛋白或包含候选靶蛋白的全细胞裂解液混合，经两步酶解后，将所得产物通过western blot、银染或考马斯蓝染色等方法检测。理论上，与无药物处理组相比，药物与候选靶蛋白结合后靶蛋白发生构象变化，不易被水解酶水解为肽段，应检测到显著条带。尽管DARTS已被广泛用于药物靶标筛选，但仍存在限制，例如仅着重分析与药物结合后对水解酶稳定性增加的靶蛋白，缺乏对水解酶稳定性减弱的靶蛋白的考察；在凝胶电泳分离的基础上对显著差异条带进行质谱鉴定，分析步骤繁琐，易造成样品损失等。
因此，本课题设计将DARTS与超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS）联用，通过UPLC-MS直接鉴定靶蛋白不同区域肽段质谱强度的变化，反应药物结合的同时可表征靶蛋白构象受药物结合影响发生变化的区域[8]。优点：（1）UPLC-MS提供了小分子与靶标特异性结合的序列及引起构象变化的区域信息；可充分考虑药物结合前后对水解酶稳定性发生变化的靶蛋白，较DARTS可提供更丰富的信息（2）高效、快速；（3）灵敏度更高，特异性更强；（4）定量检测，准确度更高等。
二、要解决的问题
1.DARTS方法优化，如非特异性酶的选择、非特异性酶解时间的选择、非特异性酶与蛋白质质量比、LC-MS参数的优化等。
2.通过钙调蛋白(calmodiun，CAM)与其小分子药物三氟拉嗪(trifluoperazine，TFP)之间的相互作用验证方法可行性，再对未知简单蛋白质-配体进行验证。
三、可行性分析
DARTS方法由2009年首次提出。根据基因启动子研究中特异性的DNA 结合位点与其相应的转录因子结合后具有抗DNA酶降解这一特性，Lomenick等推测药物与靶标蛋白结合后可能使靶蛋白构象发生变化，增加其对蛋白酶抗性，并以K506结合蛋白为研究对象，用两种与之具有较强结合活性的免疫抑制剂他克莫司（tacrolimus，FK506）和雷帕霉素（sirolimus），将枯草杆菌（Bacillus subtilis）蛋白酶作为工具酶，证实了DARTS方法的有效性[3]。同时，这一推测又在低特异性药物E4与雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）相互作用后具有抗嗜热菌蛋白酶降解中得到证实[9]。
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