开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、课题解决的问题
（本部分主要介绍所做课题需要解决的实际问题，先对实际问题进行简单扼要的描述，然后引入本论文课题所要解决的问题，并说明该课题的成果能带来的好处以及是否具体推广应用价值等，胡建华注）
数据显示我国原发性肝癌(HCC)的发病率为 466.1/10 万人，居恶性肿瘤的第三位，死亡率高达 422.1/10 万，居恶性肿瘤相关死亡率的第三位，在 60 岁以下中国男性中，HCC 是最常见和死亡率最高的恶性肿瘤[1]。我国 95%的 HCC 患者有乙肝病毒（HBV）感染背景，10%有丙肝病毒（HCV）感染背景 [2]。
传统的肿瘤治疗方式如化疗、放疗和外科手术治疗虽然对某些肿瘤有一定的疗效，但具体到 HCC 治疗中，由于恶性程度高，发展变化快，首诊病人大约只有10-25%的病人可行手术切除等治愈性治疗方案，由于肝内多存在弥散性小病灶或在单结节周围伴随卫星灶，即使是符合手术适应症的病人术后五年的复发率仍高达 40%-70%[3]。现有的传统细胞毒类系统化疗药物对 HCC 的治疗几乎无效，即使是 HCC 治疗一线靶向药物索拉菲尼对于晚期肝癌的存活期的延长也只有 3 个月左右。随着肿瘤免疫学理论和技术的研究深入,免疫细胞治疗在肿瘤治疗中的作用日益受到重视，肿瘤免疫治疗作为一种有效的创新治疗方案已成为肿瘤治疗研究领域的大热点。现今全球已有一些肿瘤免疫药物获批并开始临床应用，疗效非常显著，如：百时美施贵宝公司的 ipilimumab（抗 CTLA-4 单抗，2011），安进公司的 Blinatumomab（抗CD19CD3双抗体，2014）等，但遗憾的是在肝癌的免疫治疗领域中，相应的药物开发还是一片空白。
本课题拟在前期工作的基础上，以现有的 anti-AFP scFv 为组成，构建一个能同时靶向 AFP 阳性肝癌细胞及人 T 细胞表面TCR/CD3 复合体 CD3ε 链的双功能单链抗体 anti-CD3anti-AFP，该双功能抗体可以桥连 T 细胞和 AFP 阳性肝癌细胞，形成 T 细胞-肿瘤细胞突触样结构，理论上既保留 anti-AFP 对肝癌细胞诱导凋亡作用，同时可以激活静止 T 细胞靶向杀伤 AFP 阳性肝癌细胞, 并将这种活化局限在肿瘤局部。本课题拟进一步对该双功能单链抗体的生物学活性进行深入验证，评估该双功能抗体对T细胞的激活增殖作用，以期为肝癌免疫治疗药物，特别是手术后肝癌残留灶和微小转移灶的治疗药物的设计和开发提供一种新的思路。
二、研究方法和技术路线
(本部分主要介绍采用什么方法，采用计算机技术来实现所选课题，胡建华注)
(,这部分还可以多写一点,就是按照件工程的步骤,结合本系统设计开发的实际,简明扼要介绍每步骤需要做的工作)
以现有的 anti-AFP scFv 为组成，构建一个能同时靶向 AFP 阳性肝癌细胞及人 T 细胞表面TCR/CD3 复合体 CD3ε 链的双功能单链抗体 anti-CD3anti-AFP，以质粒22b为载体，大肠杆菌作为工程菌，并加入分子伴侣，以增加双抗蛋白的可溶性，实现该双功能抗体的大量表达及分离纯化得到有生物学活性的可溶性抗体。使用DNAMAN分析优化antiAFP序列，antiCD3序列；从公司获得含有目的基因序列的22b质粒和大肠杆菌；摸索发酵条件，温度梯度有10度，15度，20度，时间梯度有12h,16h,20h，分子伴侣有5种，在这三个变量中寻找能获得最多有生物学活性的可溶性蛋白的最适条件；确定最适条件后，进行可溶性表达及后续分离纯化工作；验证所得双抗的生物学活性，再根据期望对实验方案进行适当调整。
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