文 献 综 述
肺癌严重威胁人类生命与健康，其发病隐匿，进展迅速，约2/3的患者确诊时已失去了手术机会，而化疗是综合治疗中的主要措施之一[4]。肺癌细胞对化疗药物的耐药性特别是多药耐药性（MDR）是导致肺癌化疗失败的重要原因[8]。因此，人们一直致力于建立细胞耐药模型，并以此为模型寻找较为敏感的预测疗效的分子指标，筛选有效的耐药逆转剂[6]。
常用的抗癌药有长春新碱、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、依托泊苷、阿霉素。其中紫杉醇是美国百时美-施贵宝公司开发的一个全新植物抗癌药[5]。它是一种在红豆杉科（Taxaceae L.）红豆杉属（Taxus L.）生长缓慢的常绿乔木中分离提取到的天然化合物，1993年10月首次在美国上市，国内首次上市的时间为1995年，属于抗微管类抗癌药，是目前公认的疗效最好、抗癌谱最广的药物之一，对肺癌疗效显著[11]。它作用的药理是细胞接触紫杉醇后会在细胞内积累大量的微管，这些微管的积累干扰了细胞的各种功能，特别是是使细胞分裂停止于有丝分裂期，阻断了细胞的正常分裂。紫杉醇的这种独特的药理作用加快了其临床研究的步伐，1982年Ⅰ期临床试验开始，1989年就完成了Ⅱ期临床试验，并于1990年进入Ⅲ期临床试验，并证实了对卵巢癌和乳腺癌的疗效[10]。经过多年的不断研究，发现紫杉醇对许多不同类型的癌症都有不同程度的疗效，尤其是严重威胁人类健康的肺癌[15]。另外，紫杉醇的改良版多西紫杉醇是是对紫杉醇进行结构修饰改造得到的，是迄今研究发现的疗效最显著的抗癌药物之一，以及它的抗癌活性是紫杉醇的十倍，并且具有广谱的抗白血病和抗体体肿瘤活性，已经成为世界抗癌研究领域关注的焦点[7]。
体外建立肿瘤耐药细胞株的方法比较多，包括冲击诱导法、浓度递增诱导法或者结合两法使用，但不同类型的肿瘤会使用不同的方法[9]。人肺癌耐药细胞株的建立的方法也可使用上述方法，①冲击法结合浓度递增法，将大剂量冲击诱导法与逐步增加剂量诱导法相结合，测定肺癌A549细胞对紫杉醇的最低耐受浓度后，使用一个确定的终浓度紫杉醇培养液培养肺癌A549细胞24小时后，之后更换培养液，用含相同浓度的紫杉醇培养液培养7天，细胞稳定生长后传代，再次用含终浓度的紫杉醇培养液培养细胞24小时，更换新的含较高浓度的顺铂培养液培养7到10天，待细胞稳定生长后传代，之后逐渐增加紫杉醇浓度，每次增加浓度前都要用终浓度的紫杉醇培养液培养24小时，最终使A549细胞能在终浓度的紫杉醇培养液中稳定生长和传代[3]。②浓度递增诱导法，使用小剂量含紫杉醇的培养液培养处于对数生长期肺癌A549细胞，存活细胞生长较慢，细胞大部分死亡、等细胞生长活性、倍增时间恢复后，再增加紫杉醇剂量，直至确定细胞能在一定浓度的培养液中稳定生长，最终获得了耐药株[8]。③冲击法，用含终浓度的紫杉醇培养液培养冲击处于对数生长期的肺癌A549细胞，培养1小时后弃去含药培养液，经冲洗、胰酶消化后，以一定细胞浓度接种于不含药的新培养瓶中，第二天仍用不含药培养液换液，待细胞长至培养瓶的70%～80%时再次用含药培养液冲击，同种方法冲击多次，抗药性检测同时进行，反复冻存、复苏，观察细胞的形态学变化及其稳定性，最终得到耐药细胞株[2]。本实验采用第二种，浓度递增诱导法来获得人肺癌耐药细胞株，这种方法比第一种方法简便，比第三种方法所需的紫杉醇剂量小，经济节约，且成功率大，缺点是实验周期比较长。
获得耐药细胞株后需要检测它的耐药性，以此来检验实验成败与否。常用的有MTT法、CCK-8法、SRB法。本次实验采用MTT法，MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，商品名为噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法[1]。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比[12]。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。MTT法的优点是灵敏度高，能准确反映出活细胞的数量，从而知道药物不同浓度对细胞的抑制率，而且经济实惠。
首席医学会议频道（conference.9med.net）2015年11月20日报道，2016年第17届世界肺癌大会 (WCLC)将在奥地利-维也纳召开。由此可见，如何进行肺癌的治愈是全世界都在不停摸索和探讨的问题[13]。而由于肿瘤细胞的耐药性，越来越多的药物出现交叉耐药的的现象，紫杉醇也不例外，已有报道称紫杉醇与长春新碱、长春花碱、丝裂霉素、阿霉素等有交叉耐药[3]。所以如何解决耐药问题是提高化疗疗效的头等大事，所以，建立人肺癌耐药细胞株，可以为药物逆转细胞耐药提供实验基础，为如何治愈肺癌患者的研究迈出了一大步[14]。
参考文献
1.赵斌，葛金芳，朱娟娟，黄小晖，李俊，小议在MTT法测细胞增值抑制率中IC50的计算方法。安徽医药，2007,11（9）：834-835
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