文献综述（或调研报告）：
单分子检测 (single molecule detection, SMD) 是指在单分子水平上对生物分子的构象变化、动力学、分子之间相互作用以及对单个分子操纵的研究[1]。而纳米通道技术是二十世纪90年代中期发展起来的一种单分子检测技术，1996年，Kasianowicz等人[2]首先证明alpha;-溶血素（alpha;-HL）纳米孔可用于检测单链核酸分子（ssDNA）均聚物的转运。2001年，Li等人[3]首次使用氮化硅固体纳米孔检测单个DNA分子过孔。之后，经过二十多年的发展，纳米通道技术凭借其诸多优势在化学与生物等诸多研究领域被广泛应用。例如，检测不同癌症的生物标志物[4][5][6]，基因测序[7][8]，等等。
纳米通道技术基本原理是利用阴阳离子在外加电场作用下发生定向运动，当有分子通过设计的纳米通道时电流发生变化，通过分析电信号的变化获得分子的相关信息。而根据所使用的材料，纳米通道可分为生物纳米通道和固体纳米通道两种。常见的生物纳米通道有alpha;-溶血素（alpha;-hemolysin, alpha;-HL），气单胞菌溶素（aerolysin），MspA、phi29马达蛋白等等[9]。而固体纳米通道主要由Si3N4、石墨烯、Al2O3、聚合物薄膜等材料制备而成。
目标核酸分子的筛选与检测是纳米通道技术的一种前沿应用。核酸检测在个性化医疗和疾病分子诊断领域扮演着重要的角色，传统的核酸检测手段有很多，例如基因测序，核酸分子杂交，聚合酶链式反应（PCR，又称多聚酶链式反应），恒温扩增，生物芯片，等等。这些方法或需标定，或需扩增，通常成本较高，耗时较长。以最常用的PCR技术为例，它利用核酸分子双链复制的原理，在生物体外可以短时间内大量扩增目标核酸片段。一般采用电泳分析的方法处理PCR的扩增产物，电泳检测时间需要限制在两天以内，有些最好于当日电泳检测，这是因为超过两天后产物会出现带型不规则的现象甚至会无法检测到信息。
纳米通道技术是一项热门且应用比较前沿的单分子检测技术，可以用来检测核酸分子。以检测一种目标MicroRNA为例，其工作原理如图所示[10]，使用带正电荷的识别探针PNA作为载体与带负电荷的目标核酸分子结合成带正电荷的miRNAbull;探针复合物，在跨膜电压下，该结构可以通过纳米孔开口周围的大电场梯度驱动到纳米孔中，而任何没有与探针杂交的游离核酸都将带有负电荷并从孔中迁移出来。类似的，使用识别探针（如适体[11]）的方法极大地提高了生物纳米孔的选择性和敏感性。
图1 alpha;-溶血素纳米通道使用聚阳离子探针检测miRNA[10]
但在生物学研究和临床环境中，单一的识别目标核酸分子显然不能满足使用的需求，不足以体现纳米孔的优越性。而条形码探针方法的提出则为单纳米孔多重检测核酸分子提供了可能[12]。由于每个条形码标签特异性地阻断纳米孔，因此可以使用不同的条形码来编码不同的靶序列，不同的靶序列探针可以特异性结合对应的目标核酸分子，通过纳米孔时会产生特异的阻断信号，从而实现纳米孔多重检测。
影响纳米孔的选择性和敏感性的因素还有很多，例如，纳米孔的尺寸、壁面电荷以及外加电压等。Luan, B.和Aksimentiev, A. 的研究[13] 证明了电渗流的流体动力学阻力决定了在本体电解质和纳米孔中对DNA的有效驱动力的值。固体纳米孔中的有效驱动力（失速）可以精确描述为F = xi;mu;E，其中，xi;是摩擦系数，受到纳米孔的半径与粗糙程度影响；mu;是电泳迁移率，可通过DNA易位实验确定；E为电场强度。同时他们也证明了扩展的离子凝聚理论正确地描述了离子在电解液中的分布，但不足以预测有效驱动力的大小。Si, W.等人的研究[14]则探究了单层二硫化钼（MoS2）纳米孔边界处钼原子与硫原子的比例对DNA分子输送的影响，结果表明电渗流的方向和强度与纳米孔边界处Mo原子与S原子的比例高度相关，Mo/S为0.17是纳米孔输运能力的突变点，当Mo/S小于0.08时，顺式侧的DNA甚至不能渗透过纳米孔。Mo/S实际影响的可能是纳米通道的附近电荷，使得纳米孔对正负粒子有了不同的亲和性。而Wang, Y.等人的研究[4]中初步反映了外加电压会对输运核酸分子的时间产生影响，电压越大，核酸分子的过孔时间越短。最近，Xiaojun Wei等人系统地研究了电化学环境对宿主-客体相互作用的影响，特别是通过改变抗衡离子（Li ，Na ，K ），pH和电解质浓度对alpha;-HL纳米孔中的特征信号的影响。[15]结果表明，pH的变化会缩短或延长振荡信号事件的持续时间。不对称浓度影响特征事件的频率，而抗衡离子的核电荷数影响振荡信号的产生，甚至影响纳米孔的插入。与此同时，HCR (Hybridization chain reaction，杂交链反应)被成功地用于放大检测ctDNA的纳米孔信号[16]，根据其结果，传感策略表现出了良好的选择性。另外，陈洪渊、黄硕团队在2019年9月份报告了一种新型的纳米孔检测方法，并将其命名为无电极纳米孔技术（DOP，DiffusiOptoPhysiology），这也是世界首个无需电极的单分子纳米孔检测方法。该团队通过对电解质溶液与孔道进一步的优化，其传感性能可与传统的电生理纳米孔技术相当，而理论检测密度可高达104 pores/mm2。[17]
综上所述，纳米通道技术无论是在国内还是在国外都是热门前沿，并且前人已经对该技术的研究与应用做出了很多贡献。从他们的研究中可以发现纳米孔尺寸、外加电压、壁面电荷等因素都会对核酸分子的输运产生影响，而为便于观察各因素对核酸分子输运的具体影响，固体纳米孔是合适的目标纳米通道仿真模型。同时，深入研究纳米孔尺寸、壁面电荷、外加电压等因素对流体、单双链核酸分子以及离子输运的影响会仍然会为调控纳米孔的选择性和敏感性提供更多的经验与方法。
参考文献
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